单核细胞增生李斯特菌毒力基因actA转录调控机制的初步研究和缺失突变株的构建

摘要

单核细胞增生李斯特菌，简称单增李斯特菌（LM）是常见的食源性致病菌，2002年被WHO列为仅次于大肠杆菌O157，沙门氏菌、志贺氏菌后的第四大重要的食源性致病菌。单增李斯特菌是一种人畜共患病李斯特菌病的病原，主要通过食用被LM污染的食品而感染。孕妇、婴儿、老年人及免疫力低下者如肿瘤、AIDS的患者均容易引起感染，导致胃肠炎、败血症、脑膜炎、流产等。欧美国家曾多次发生该菌引起的食物中毒，死亡率达30％以上。一方面，LM对食品的污染与危害，已引起世界各国的普遍关注和高度重视；另一方面，在逐步研究过程中发现，LM具有显著激发强烈的CD4+／CD8+T细胞免疫反应和较弱的体液反应能力，减毒LM突变株因而可以成为研制新型抗感染药物和生物治疗肿瘤的理想外源性抗原表达载体，减毒LM是非常有前景的疫苗载体。鉴于LM的致病原理主要是毒力因子的协作参与，对于LM毒力基因表达调控机制的研究就是一个尤为重要的课题。本研究通过同源重组的方式，在基因组中已经缺失了inlB毒力基因（ΔinlB LM）基础上再进行actA基因的缺失，由此获得LMΔinlB／actA减毒突变株；同时构建表达GFP的LM，并以突变株开展了GFP用于PrfA调控毒力基因actA转录表达的研究。 减毒突变株的获得不仅对李斯特菌病的预防具有重要作用，为LM阐明毒力因子的致病机理与免疫防护作用提供条件，为构建预防人类和动物李斯特病的疫苗载体奠定基础；并且，缺失突变株的获得也有助于对LM毒力基因表达调控机制的研究，起到提高食品卫生安全作用和促进其在临床上应用的实现。 一单核细胞增生李斯特菌LM4inlB／acth减毒突变株的构建及鉴定actA和inlB基因的编码产物ActA和InlB是与其致病性相关的重要毒力因子，本研究通过删除这两个基因实现野生型菌株LM的减毒；在以前的研究结果（基因组中inlB基因已经成功缺失）基础之上，进行actA基因的敲除。利用PCR技术成功扩增待删除基因actA上游c、下游d片段，通过pUC18-actA（c+d）克隆载体的构建，将其拼接在一起，测序后插入穿梭载体pLSV101中，经电转化导入 LMΔinlB。通过温度和红霉素抗性压力，实现同源重组，对重组克隆用PCR方法进行鉴定，将阳性克隆命名为LMΔinlB／actA。 二GFP介导的PrfA调控毒力基因actA转录表达研究构建表达融合载体pLSV16-PactA-gfp将无启动子的绿色荧光蛋白基因gfp与毒力基因actA启动子融合，然后将其电转化入LM野生株P14、PrfA高表达突变株P14a和prfa基因等位缺失突变株A42中进行表达，利用荧光显微镜和荧光酶标仪检测上述三株细菌中绿色荧光蛋白的不同表达强度，从而评价actA基因依赖于PrfA的转录活性强弱，以研究PrfA转录调控毒力基因表达的分子机制；结果显示：绿色荧光蛋白在P14a中发出的荧光强度最高，P14次之，A42最弱，两两比较均有显著差异（p<0.01），表明毒力基因actA的转录水平高低与PrfA的活性成正相关，其转录表达依赖于PrfA的调控。 本研究所获得的减毒突变株毒力水平有很明显的降低，具有良好的安全性，可作为治疗肿瘤的理想外源性抗原表达载体。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1流行病学方面

1.1.1生物学特性

1.1.2流行病特征

1.1.3李斯特菌病的临床表现

1.1.4 LM的分类

1.1.5李斯特菌病的预防监控

1.1.6治疗方案

1.2 LM致病机理及研究进展

1.2.1 LM感染细胞的生活周期

1.2.2 LM的毒力因子及其调控

1.3 LM的免疫反应及LM疫苗载体的应用

结 语

第二章单核细胞增生李斯特菌△inlB／△actA LM减毒突变株的构建

2.1实验材料

2.1.1菌株与质粒 (见表2-1)

2.1.2引物的设计

2.1.3试剂

2.1.4主要实验仪器

2.2.方法

2.2.1 actA基因上下游c／d片段的扩增

2.2.2 pUC18-actA(c+d)克隆载体的构建

2.2.3基因敲除质粒pLSV101-actA(c+d)的构建

2.2.4 LM△inlB感受态细胞的制备

2.2.5转化

2.2.6 LM△inlB／△actA减毒突变株的构建

2.2.7 PCR鉴定LM△inlB／△actA

2.2.8 LM减毒株的小鼠致病性实验

2.3结果

2.3.1 actA基因上、下游片段的扩增结果

2.3.2 pUC18-actA(e+d)克隆载体的构建及鉴定结果

2.3.3基因敲除质粒pLSV101-actA(c+d)的构建及鉴定结果

2.3.4重组LM的构建与鉴定

2.3.5减毒株LM△inlB／△actA的LD50测定

2.4讨论

第三章GFP介导的PrfA调控毒力基因actA转录表达研究

3.1材料

3.1.1菌株(见表3-1)

3.1.2质粒

3.1.3主要实验仪器

3.1.4试剂

3.2方法

3.2.1模板的制备DNA和PCR片段的纯化回收

3.2.2表达融合载体pLSV16-PactA-gfp的构建和鉴定

3.2.3表达GFP的LM的构建

3.2.4绿色荧光蛋白的表达与荧光强度的检测

3.3 结果

3.3.1.actA启动子的扩增

3.3.2无启动子的gfp基因的获得

3.3.3 GFP重组质粒PCR鉴定

3.3.4含gfpLM的转化鉴定

3.3.5绿色荧光蛋白表达的检测

3.4讨论

4 小结

总结

参考文献

已论文发表

致谢