Ryanodine对Rapamycin诱导的EOCs功能抑制及其相关eNOS蛋白表达及活性的影响

摘要

目的：探讨理阿诺碱(Ryanodine)对雷帕霉素(Rapamycin)诱导的内皮生长晕细胞(Endothelialoutgrowthcells，EOCs)功能抑制的影响及其相关内皮型一氧化氮合酶(endothelialNitric-OxideSynthase，eNOS)蛋白表达及活性的影响。
　　 方法：采用密度梯度离心法分离30ml脐血中的单个核细胞(Mononuclearcells，MNC)，接种至事先包被有人纤维连接蛋白的6孔培养板的一孔中(约10cm2)。加入2ml含10％胎牛血清的EGM-2培养基。培养24h后吸除上清及悬浮细胞，贴壁细胞加2ml上述培养基继续培养。此后一周内每24h换1/2原液，一周后每72h换全液并于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。待铺路石样细胞生长汇合后传代，扩增后取第二代细胞采用CD34、Flk-1、Ⅷ因子相关抗原免疫组化及DiI-ac-LDL、FITC-UEA-I双荧光染色法鉴定培养细胞的内皮属性。
　　 取第二代EOC分为四组：(1)对照组：加入配制雷帕霉素和理阿诺碱的溶剂(0.3％DMSO)：(2)雷帕霉素干预组：加入10nmol/L雷帕霉素；(3)雷帕霉素和理阿诺碱共同干预组：提前1h加入10μmol/L理阿诺碱，再加入10nmol/L雷帕霉素；(4)理阿诺碱干预组：加入10μmol/L理阿诺碱，各组细胞继续培养24h后观察结果。
　　 经上述处理后的细胞分别采用CCK8检测细胞增殖能力、Transwell小室检测细胞迁移能力、倒置显微镜下检测细胞的粘附能力。用特异性的eNOS抗体及Phospho-eNOS（Thr495）抗体的蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测eNOS的蛋白表达及活性。
　　 结果：采用密度梯度离心法分离人脐血获得的单个核细胞在培养约第4～6天开始出现梭形细胞，第7～9d形成若干个细胞集落，此后细胞集落逐渐增大至相互汇合，在倒置相差显微镜下可见细胞呈现椭圆形铺路石样排列，并具有极强的克隆增殖能力。
　　 通过激光扫描共聚焦显微镜鉴定，第二代EOCs能够摄取ac-LDL并结合UEA-I，双阳性率为100％。免疫组化染色显示第二代EOCs的Ⅷ因子相关抗原、CD34、Flk-1表达阳性率均为100％。
　　 EOCs与10nmol/L雷帕霉素共孵育24h后细胞的增殖能力、迁移能力、黏附能力均较对照组减弱，分别为0.64±0.04vs0.78±0.03(P＜0.05)，31.73士1.80vs54.20±1.25(P＜0.05)和2.42±0.74vs7.08±1.13(P＜0.05)。10μmol/L理阿诺碱预处理1h能改善雷帕霉素对EOCs的增殖、迁移、黏附能力的抑制作用：雷帕霉素和理阿诺碱共同干预组细胞增殖、迁移、黏附能力与雷帕霉素干预组相比分别为：0.73±0.03vs0.64±0.04(P＜0.05)，41.40±1.25vs31.73±1.80(P＜0.05),4.30+1.49vs2.42士0.74(P＜0.05);10μmol/L理阿诺碱单独作用对EOCs的增殖、迁移、黏附能力、无显著影响。理阿诺碱干预组细胞增殖、迁移、黏附能力与对照组相比分别为：0.72±0.06vs0.78±0.03(P＞0.05)，52.13±1.21vs54.20±1.25(P＞0.05),6.03±1.65vs7.08±1.13(P＞0.05)。
　　 通过Werstern-blot对各组细胞总eNOS蛋白表达及eNOS(Thr495)磷酸化水平的检测，发现与对照组相比10nmol/L雷帕霉素对总eNOS蛋白表达水平无显著影响0.51±0.14vs0.73±0.17（P＞0.05），但增强eNOS(Thr495)的磷酸化水平0.76±0.09vs0.50±0.04(P＜0.05);与雷帕霉素组相比，10μmol/L理阿诺碱预处理1h对总eNOS蛋白表达无显著影响0.52±0.14vs0.51±0.14(P＞0.05)，但降低eNOS(Thr495)的磷酸化水平，0.56±0.13vs0.76±0.09(P＜0.05);与对照组相比，10μmol/L理阿诺碱单独作用对总eNOS蛋白表达及eNOS(Thr495)磷酸化水平无显著影响，分别为：0.52±0.16vs0.73±0.17（P＞0.05），0.51±0.11vs0.50±0.04(P＞0.05)。
　　 结论：用贴壁培养法可以在体外成功培养获得人脐血EOCs。通过荧光细胞化学染色及免疫组化染色可以证实培养细胞具有内皮特性。
　　 雷帕霉素抑制EOCs的增殖、迁移、黏附能力、增强eNOS(Thr495)磷酸化水平，对eNOS蛋白表达无显著影响；理阿诺碱可以改善雷帕霉素诱导的对体外培养的EOCs增殖、迁移、黏附能力的抑制，降低eNOS（Thr495）磷酸化水平，对eNOS蛋白表达无显著影响。
　　 理阿诺碱对雷帕霉素诱导的EOCs功能抑制的保护作用，至少部分是通过降低EOCs的eNOS(Thr495)磷酸化水平来实现的。