亨廷顿蛋白相关蛋白1在胰岛中的定位及对小鼠胰岛B细胞系NIT--1细胞凋亡的影响

摘要

亨廷顿蛋白相关蛋白1(Huntingtin-associated protein1，HAP1)是在大鼠脑中发现的第一个与亨廷顿病(Huntington’s disease，HD)致病基因产物亨廷顿蛋白(Huntingtin，Htt)有相互作用的蛋白质。最初的研究表明，HAP1广泛分布在神经系统，以在下丘脑的表达水平最高。下丘脑是内分泌系统的调节中枢，HAP1在下丘脑高水平的表达提示HAP1可能与内分泌功能有关。我们前期的研究表明，HAP1不仅存在于神经系统，也存在于甲状腺、肾上腺髓质、胰岛等内分泌器官以及胃肠道内分泌细胞中。免疫组织化学研究表明，在胰腺，HAP1主要分布在胰岛的B细胞中，而胰岛A细胞和D细胞中不含HAP1。已有研究表明HAP1能抑制神经元的凋亡，对神经元起保护作用。Ⅰ型糖尿病是一种自身免疫性疾病，它和HD一样，被认为是一种凋亡过度所致的疾病。那么在胰岛B细胞中特异性分布的HAP1是否也与神经元中的HAP1一样对B细胞起一个抗凋亡作用呢?本项目在应用原位杂交和RT-PCR技术进一步观察HAP1在胰岛的分布的基础上，研究HAP1对小鼠胰岛B细胞系NIT-1细胞凋亡的影响。 一、HAP1特异性表达于胰岛B细胞我们以前的免疫组织化学研究表明，HAP1免疫反应阳性细胞广泛分布于大鼠胰岛中，胰腺外分泌部无HAP1的表达；免疫荧光双标显示，胰岛中HAP1阳性细胞几乎都呈胰岛素免疫反应阳性，但未见HAP1-胰高血糖素和HAP1-生长抑素双标细胞。本部分应用原位杂交(In Situ Hybridization，ISH)、免疫荧光双标及RT-PCR技术进一步观察THAP1在胰岛中的分布。原位杂交组织化学显示，HAP1mRNA特异性表达于大鼠胰岛中，胰腺外分泌部无HAP1mRA的表达；免疫荧光双标显示，未见HAP1-胰多肽双标细胞；RT-PCR结果显示，大鼠脑组织、胰岛原代细胞及NIT-1细胞(小鼠胰岛B细胞系)中都有HAP1 mRNA的表达。上述结果表明，HAP1选择性定位于胰岛B细胞中，可能和胰岛B细胞的某些功能活动有关。 二、HAP1基因沉默对小鼠胰岛B细胞凋亡的影响已有研究表明HAP1能抑制神经元的凋亡，对神经元起保护作用。在胰岛B细胞中特异性分布的HAP1是否也与神经元中的HAP1一样对B细胞起一个抗凋亡作用呢?本部分采用化学合成针对小鼠HAP1基因的siRNA，转染小鼠胰岛B细胞系(NIT-1细胞)，抑制NIT-1细胞HAP1的表达后，应用AnnexinV/PI染色和原位末端核苷酸标记法(TUNEL)检测沉默HAP1的表达后对NIT-1细胞凋亡的影响。结果显示，HAP1 siRNA实验组，NIT-1细胞凋亡数增多，凋亡率显著高于空白对照组(P<0.01)；链脲佐菌素(STZ)能明显诱导NIT-1细胞的凋亡，沉默HAP1的表达能增加STZ所诱导的NIT-1细胞的凋亡。表明特异性分布在胰岛B细胞中的HAP1和神经元中的HAP1一样，对胰岛B细胞的凋亡有保护作用，且对凋亡诱导剂所诱导的B细胞的凋亡也有保护作用。