EB病毒感染调控长链非编码RNA H19参与胃癌发生发展的研究

摘要

目的：①筛选胃癌细胞系AGS稳定感染EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)后差异表达的长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)，为探讨EBV的致瘤机制提供理论及实验基础。②明确EBV阳性和阴性胃癌细胞系以及组织标本中lncRNA H19的表达水平及差异；探讨EBV感染对胃癌组织中H19启动子区甲基化水平、H19印记状态的影响。
　　方法：①采用高通量转录组测序(RNA-Seq)技术对 AGS细胞系和稳定感染 EBV的AGS-EBV细胞系进行转录组测序。②对获得的测序数据进行生物信息学分析，包括lncRNAs表达水平分析、差异表达 lncRNAs的靶基因预测，以及预测靶基因的GO(Gene Ontology)富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析。③采用实时荧光定量qRT-PCR检测EBV阳性胃癌细胞系(GT-38、GT-39、SNU719、AGS-EBV)、EBV阴性胃癌细胞系(MKN-45、SGC7901、HGC-27、AGS)、EBVaGC及EBVnGC组织中lncRNA H19的表达水平。④亚硫酸氢盐基因组测序法(bisulfate genomic sequencing，BGS)及sequenom MassArray飞行质谱法检测EBV阳性及阴性胃癌细胞系、EBVaGC及EBVnGC组织中H19启动子区甲基化状态；结合检测区434G/T多态性位点，对多态性位点434G/T杂合型标本进行H19启动子区等位基因特异性甲基化分析。⑤依据H19第5外显子区有单一的RsaⅠ多态性酶切位点，采用限制性片段长度多态性(restrictive fragment length polymorphisms，RFLP)结合PCR技术（RFLP-PCR)检测EBVaGC和EBVnGC组织中H19基因的印记状态。
　　结果：①与AGS细胞系相比，AGS-EBV细胞系中发现879条差异表达的lncRNAs，包括47条表达上调，832条表达下调；其中24条lncRNAs在AGS中不表达，243条lncRNAs在AGS-EBV中不表达。差异表达的lncRNAs中有肿瘤相关性lncRNAs，如H19和CCAT1已经证明与多种肿瘤的发生有关。②部分差异表达的lncRNAs预测到靶基因，通过 GO富集分析发现预测的靶基因参与了多种生物学过程(biological_process)、细胞成分的组成(cellular_component)及分子功能(molecular_function)。有些lncRNA的靶基因与凋亡过程(apoptotic process)、细胞周期阻滞(cell cycle arrest)及细胞增殖(cell proliferation)等密切相关。靶基因的KEGG分析结果显示，这些靶基因主要参与氧化磷酸化、代谢途径、内吞作用、唾液腺分泌、胰腺分泌及某些代谢性疾病如Alzheimer症、Huntington病和Parkinson病等途径。③4种EBV阳性细胞系lncRNA H19平均表达水平明显低于4种EBV阴性细胞系(0.04789±0.02991vs4.061±0.4192，P<0.001)；EBVaGC组织中lncRNA H19的平均表达水平明显低于EBVnGC(0.7024±0.4000vs3.646±0.7058，P<0.001)。④EBV阳性细胞系H19启动子均呈高甲基化状态，而EBV阴性细胞系仅个别CpG位点呈甲基化状态，EBV阳性细胞系H19启动子CpG甲基化率明显高于EBV阴性组。BGS法及质谱法检测结果显示21例EGVaGC及17例EBVnGC组织标本中H19启动子平均甲基化率均接近50％，差异无统计学意义(P=0.7791，P=0.729)；两组间高甲基化及低甲基化标本组成也无显著性差异(P=0.721)。对 EBVaGC及 EBVnGC组织中434G/T杂合性标本(各5例)进行了等位基因差异性甲基化分析，结果显示EBVaGC组织中，一条等位基因保持几乎均完全甲基化状态，另一条等位基因亦出现了不同程度的甲基化，其中PL455两条等位基因均几乎完全甲基化；EBVnGC组标本一条等位基因保持几乎均完全甲基化状态，另一条等位基因保持几乎完全未甲基化状态，但Q589两条等位基因均几乎完全未甲基化，EBVaGC组H19启动子甲基化程度高于EBVnGC组。⑤自39例EBVaGC及86例EBVnGC标本中分别筛选出H19第5外显子区RsaⅠ多态性酶切位点杂合型标本24例及28例；有6例EBVaGC组织中(25%，6/24) H19呈双等位基因表达，EBVnGC中亦有6例(21.43%，6/28) H19呈双等位基因表达，两组间H19印记丢失率无统计学差异(P=1.00)。
　　结论：①EBV稳定感染AGS细胞系可导致宿主细胞lncRNAs表达水平发生改变，以表达下调的lncRNAs居多。部分差异表达的lncRNA与肿瘤的发生密切相关。②差异表达的lncRNAs参与了多种细胞生物学活动，提示EBV可以通过lncRNA进一步作用于其靶基因，进而更广泛地影响宿主基因的转录调控，参与EBV相关肿瘤的发生发展。③EBV感染对胃癌细胞中lncRNA H19的表达具有显著影响，EBV可能通过调控lncRNA H19的表达参与EBVaGC的发生与发展。④EBV阳性细胞系H19启动子区甲基化水平明显高于 EBV阴性细胞系，启动子区甲基化程度与 lncRNA H19的表达水平密切相关，是调控H19表达的重要因素。但EBVaGC和EBVnGC组织中H19启动子区甲基化程度无显著性差异，提示体内除启动子甲基化外，尚有其它因素参与H19转录表达的调控。⑤胃癌组织中存在一定比例的H19印记丢失，这可能是胃癌组织中 H19表达水平增高的原因之一，EBV感染对胃癌组织中 H19基因的印记丢失无明显影响。

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第一部分 基于RNA-Seq的EB病毒感染前后胃癌细胞系AGS中差异表达长链非编码RNA(lncRNA)的筛选

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Abstract

引言

第一章 材料与方法

第二章 结果

第三章 讨论

研究结论

参考文献

第二部分EB病毒感染调控长链非编码RNA H19参与胃癌的发生及其机制探讨

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ABSTRACT

引言

第一章 材料与方法

第二章 结 果

第三章 讨论

研究结论

参考文献

综述

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