重组E.coliγ-ggt和gs原核表达载体的构建、蛋白诱导表达与应用和Hsp70、Hsp90及TAK1相关真核表达载体的构建及鉴定

摘要

谷胱甘肽(Glutathione)广泛存在于各种生物体中，主要用于维持胞内正常的氧化还原状态，是生物体内的自由基清除剂，具有抗氧化、解毒、保护细胞等重要的生理作用，在临床医药、食品工业、保健品等方面有着非常广泛的用途。近年来，Glutathione的生产方法主要有溶剂萃取法、发酵法、酶转化法及化学合成法。由于直接从组织中分离提取的成本比较高，化学合成法的分离提纯过程又十分困难，酶转化法合成GSH的产率高、后续的分离提取较简单而倍受关注。 茶氨酸(L-Theanine)学名为N-乙基-γ-氨基-L-谷氨酰胺(N-ethyl-γ-L-glutamine)，是天然茶叶中的一种特殊氨基酸，也是茶叶具有鲜爽味的主要成分，于1985年得到FDA认可，并确认合成茶氨酸为GRAS，在使用时不作限制用量的规定，茶氨酸作为一种新型的食品添加剂，不仅易溶于水，还有抑制苦味物质，改善食品风味的作用，在食品工业中得到了广泛的应用。此外，茶氨酸还具有降血压、增强抗癌药物的疗效、提高免疫力、松弛神经紧张等药理作用。但由于直接从茶叶中提取高纯度茶氨酸的成本比较高昂，茶氨酸的人工合成，特别是微生物发酵合成方法一直是人们研究的热点。 γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase，γ-GGT，EC 2.3.2.2)是生物体内谷胱甘肽代谢途径中的一个关键酶，广泛分布在活体组织中。在大肠杆菌中，此酶在自身信号肽的介导下被转运至周质空间中发挥其生理作用。它不仅可以催化γ-谷氨酰基化合物的水解反应生成γ-谷氨酸，还可以催化γ-谷氨酰基化合物上的γ-谷氨酰基团转移至氨基酸、多肽、H2O等受体上。利用其这一特性，可以催化合成谷胱甘肽和茶氨酸。为了提高微生物中γ-谷氨酰转肽酶的产量及可溶组分，本实验从大肠杆菌k-12中克隆出γ-ggt基因片段，转入原核表达载体pET28a(+)、pET32a(+)和pGEX-4T-1中，构建了重组质粒，并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，以廉价、无毒的乳糖作为诱导剂，测定目的蛋白的表达特性，并在此基础上利用该酶催化合成谷胱甘肽和茶氨酸。 实验结果表明，构建的重组质粒pGEX-4T-1/γ-ggt转化大肠杆菌BL21(DE3)，乳糖诱导后表达产生的γ-谷氨酰转肽酶具有更高的蛋白可溶性和酶活，在反应条件优化基础上，利用重组大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶，茶氨酸最大生成量目前可达到80～90g/L，谷胱甘肽的合成仍在进一步研究中。

目录

声明

第一部分重组E.coli γ-ggt和gs重组原核表达载体的构建、蛋白诱导表达与应用

摘要

第一章研究背景

第一节谷胱甘肽的研究背景

第二节茶氨酸研究的历史与现状

第三节γ-谷氨酰转肽酶的研究背景

第二章大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶及谷胱甘肽合成酶表达系统的构建

1.实验目的

2.实验步骤

3.实验材料

4.实验方法

5.实验结果

6.讨论

第三章大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶及谷胱甘肽合成酶的表达及应用

1.实验目的

2.实验材料

3.实验方法

4.实验结果

5.讨论

参考文献

第二部分Hsp70、Hsp90及TAK1相关真核表达载体的构建及鉴定

摘要

第一章研究背景

第一节热休克蛋白70的研究背景

第二节热休克蛋白90的研究背景

第三节转化生长因子β激活激酶1

第二章人诱生型HSP70真核表达载体的构建及其在HEK293内的表达

1.实验目的

2.实验材料

3.实验方法

4.实验结果

5.讨论

第三章HSP90、TAK1相关缺失突变体的真核表达载体构建

1.实验目的

2.实验设计

3.实验材料

4.实验方法

5.实验结果

6.讨论

参考文献

附录

致谢