仔猪源高粘附性乳酸杆菌的分离鉴定、肠道定植及其粘附相关表面蛋白功能分析

摘要

乳酸杆菌作为益生菌具广泛的益生效应，其在畜禽胃肠道中广泛存在，维持着机体胃肠道微生态的平衡，促进动物健康。在我国养殖业中，乳酸杆菌常被添加至饲料中，以促进动物生长，维持动物健康。特别是在仔猪饲养过程中，添加乳酸杆菌能有效预防仔猪腹泻，其使用价值备受重视。而细菌对肠壁的黏附和定植是其发挥益生效应的基础，因此益生菌的粘附机制粘附显得至关重要。本研究首先从仔猪肠道分离获得高粘附性的乳酸杆菌，侧重研究仔猪来源高粘附性乳酸杆菌的益生效应及其粘附机制，探索表面蛋白在乳酸杆菌粘附宿主过程中的重要作用，致力于解析自然粘附的乳酸杆菌表面蛋白的粘附共性，为乳酸杆菌的高效定植提供理伦指导，对筛选和培育仔猪高效乳酸杆菌等益生菌具有重要意义。
　　一、仔猪肠道高粘附性乳酸杆菌的分离鉴定及属性研究
　　1.乳酸杆菌的分离鉴定（试验一）。利用MRS选择性固体培养基从28日龄断奶杜长大仔猪的不同肠段（空肠和回肠）的食糜及粘液中分离纯化获得85株菌株，根据16S rDNA基因测序鉴定为:约氏乳酸杆菌(Lactobacillus johnsonii,L.johnsonii)1株、唾液乳酸杆菌（L.salivarius）54株和罗伊氏乳酸杆菌(L.reuteri)30株，乳酸杆菌16S rDNA基因测序获得基因序列经提交GenBank后获得基因登录号，经过糖发酵鉴定后鉴定结果显示乳酸杆菌鉴定结果呈多样性，为不同的乳酸杆菌。获得的85株乳酸杆菌中36株来自空肠食糜、空肠粘液18株、回肠食糜3株和回肠粘液28株。
　　2.高粘附乳酸杆菌筛选（试验二）。从仔猪肠道获得高粘附性乳酸杆菌，为研究乳酸杆菌粘附机制及开发仔猪同源性应用菌株打下基础，本试验根据乳酸杆菌的显微镜检测及基因序列的进化树分析结果挑选出40株乳酸杆菌进行体外粘附性筛选，乳酸杆菌与Caco-2细胞系体外共培养后经革兰氏染色，在光学显微镜下观察乳酸杆菌的粘附数量。研究结果显示6株乳酸杆菌具较高粘附能力，显著高于其他细菌(P＜0.05)，其中含唾液乳酸杆菌1株和罗伊氏乳酸杆菌5株。
　　3.高粘附乳酸杆菌的属性研究（试验三）。该试验研究了高粘附乳酸杆菌的耐酸和耐胆盐能力，同时观察其细菌自凝聚能力和其对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制作用。结果显示高粘附ZJ617和ZJ621菌株具良好的耐酸耐胆盐能力，与低粘附性乳酸杆菌相比，高粘附性菌株具良好的自凝聚作用，在6h时某些菌株自凝聚高达80％，远高于LGG商用菌株(28.5％)。通过竞争、排斥和驱除三个小试验研究几株高粘附能力菌株的抑菌效果，发现其能显著抑制大肠杆菌K88及沙门氏菌50335对Caco-2细胞的粘附(P＜0.05)。本试验进一步分析乳酸杆菌粘附性与其抑菌效果的相关性，发现乳酸杆菌粘附性高低与竞争性抑制大肠杆菌和沙门氏菌试验结果呈正相关，相关系数为0.68和0.50(P＜0.05)，而在驱除方面无显著相关性，说明乳酸杆菌的早期定植能有效预防致病菌对宿主的侵害。
　　二、仔猪肠道高粘附性乳酸杆菌表面蛋白的功能分析
　　1.乳酸杆菌粘附表面蛋白的分离鉴定及结构解析（试验四）。乳酸杆菌在肠道内的粘附定植是其发挥益生效应的基础和前提，而乳酸杆菌表面的蛋白质及其他组分在其粘附过程中发挥重要作用。本研究致力研究乳酸杆菌表面蛋白质在其粘附过程中的作用。通过生物素标记Caco-2细胞和IPEC-J2细胞，并结合Western-blot杂交技术确认乳酸杆菌表面的粘附性蛋白。杂交结果显示罗伊氏乳酸杆菌（L.reuteri）存在着一种粘附性蛋白，该蛋白分子质量约为37 kDa,经质谱鉴定为GAPDH蛋白，该蛋白和L.reuteri JCM1112(登录号YP_001841377)具有100％的同源性。软件分析结果显示该蛋白为亲水性蛋白，含跨膜区域，在GAPDH蛋白质的第149-164位氨基酸，氨基酸依次丙氨酸-甘氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-苏氨酸-苏氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-亮氨酸-丙氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-丙氨酸-赖氨酸-缬氨酸-亮氨酸。
　　2.乳酸杆菌粘附性表面蛋白在大肠杆菌中表达（试验五）。为验证GAPDH蛋白在乳酸杆菌粘附肠道及抑制致病菌过程中的作用并研究其在乳酸杆菌表面的定位，本试验通过体外大肠杆菌表达系统获得了该蛋白，通过抗His标签利用镍胶亲和层析法纯化目的蛋白并制备兔抗多克隆抗体。本试验成功获得纯度达96％的乳酸杆菌表面蛋白GAPDH，并成功制备获得抗体。经验证该抗体效价合格，且能有效检测到目的蛋白。
　　3.乳酸杆菌粘附性表面蛋白功能分析及其在细菌表面的定位（试验六）。研究发现将蛋白去除或用抗体封闭后其粘附性和抑菌能力显著下降(P＜0.05)，说明该蛋白在L.reuteri粘附肠道上皮细胞及抑制致病菌粘附肠道上皮细胞的过程中发挥重要作用。免疫电镜及间接免疫荧光的研究结果显示GAPDH蛋白不仅在L.reuteri其胞质同时在其在表面的定位，揭示GAPDH蛋白存在罗伊氏乳酸杆菌菌表面。
　　三、高粘附性罗伊氏乳酸杆菌在小鼠及仔猪肠道内的定植分布及益生效应。
　　1.高粘附性罗伊乳酸杆菌在小鼠肠道内的动力学分布（试验七）。为验证高粘附性罗伊氏乳酸杆菌在体外粘附试验结果，研究其在受试动物中应用的安全性及其在动物肠道内的分布与定植状态，本试验挑选80只6周龄健康雄性BALB/c进行体内试验，将小鼠根据体重平均分配成4组，即对照组、ZJ615乳酸杆菌组、ZJ617乳酸杆菌组和ZJ621乳酸杆菌组。为计算肠道上皮和排出的粪便中乳酸杆菌的定植数量，试验通过链霉素对乳酸杆菌菌株进行抗性筛选，获得抗链霉素菌株。试验全长为13天，持续灌胃3天后，于停止灌胃后的第1天、第3天、第6天和第10天每组引颈处死5只小鼠，检测小鼠肠道内空肠、回肠和结肠段内粘附定植及排出的粪便中乳酸杆菌的数量。结果显示罗伊氏乳酸杆菌对小鼠健康未造成影响，小鼠体态和饮食正常，意味分离获得的菌株安全，可进行饲喂试验。同时和对照组和低粘附性菌株相比，高粘附菌株L.reuteri ZJ617和ZJ621在小鼠回肠和结肠段大量定植，粪便中乳酸杆菌呈持续的排出状态，说明高粘附性罗伊氏乳酸杆菌菌株在小鼠肠道内具良好的定植能力。
　　2.高粘附性罗伊氏乳酸杆菌在新生仔猪肠道内的定植状况及对其生长性能、仔猪肠道发育和免疫指标的影响（试验八）。为揭示高粘附性罗伊氏乳酸杆菌在新生仔猪肠道内的定植状态及对其生长性能等方面的益生作用。实验选取初生杜洛克仔猪50头，公母各半，根据体重和窝源基本一致的原则随机分成5组，每组10头，五组分别为对照组、低粘附性罗伊氏乳酸杆菌ZJ615、高粘附性乳酸杆菌ZJ617、乳酸杆菌ZJ621和阳性对照商用菌株鼠李糖乳酸杆菌LGG组。出生后的前2天为初乳期，仔猪出生第3天进行试验处理，正式灌胃为14天，饲喂剂量逐步增加，从103至109 cfu，每两天增加一个数量级的菌，总计灌喂量2.22×109 cfu，饲养期共25天，仔猪在21日龄时进行早期断奶。饲喂期间每天观察各组间仔猪腹泻情况，并在仔猪13、17、21、25日龄时收集肛门处粪便，计算每克粪便中乳酸杆菌的数量。仔猪在25日龄时进行称重，然后每组选择4头仔猪进行屠宰，取肠段固定，制作切片，染色，分析仔猪空肠和回肠绒毛高度、隐窝深度和肠绒毛上皮淋巴细胞的数量。取仔猪空肠、回肠和结肠涂板计算肠道上粘附的乳酸杆菌的数量。仔猪屠宰时收集血，析出血清分析IL-10和TNF-α细胞因子的表达量。试验结果显示饲喂高粘附性乳酸杆菌对仔猪日增重无影响，但能显著降低仔猪腹泻和提高仔猪空肠和回肠的绒毛高度，及绒毛上淋巴细胞的数量(P＜0.05)，促进肠道的发育。仔猪肠段及粪便抗性涂板结果显示高粘附性乳酸杆菌在仔猪后肠段回肠和结肠能进行定植，仔猪断奶前粪便中的乳酸杆菌排出数量由高到低后趋于稳定状态，但断奶后排出数量显著降低。
　　综上所述，本试验从仔猪肠道分离获得高粘附性菌株，该菌株具良好的耐酸、耐胆盐等益生特性。高粘附性罗伊氏乳酸杆菌表面具粘附性蛋白GAPDH，其在细菌细胞质和表面均有分布和表达，且在乳酸杆菌粘附肠道细胞及抑制致病菌过程中发挥重要作用。体内试验发现高粘附性罗伊氏乳酸杆菌能在动物肠道内稳定定植，有效防止仔猪腹泻。

目录

声明

图表一览

主要缩略语与符号一览表

摘要

引言

第一章 文献综述

第一节 乳酸杆菌的益生作用及其应用概况

1 乳酸杆菌的研究进展

2 乳酸杆菌在动物生产中的应用现状

第二节 乳酸杆菌肠道粘附机制的研究进展

1 乳酸杆菌表面粘附配体物质

2 粘附受体

3 影响乳酸杆菌粘附的因素

第三节 乳酸杆菌表面蛋白研究进展

1 表面蛋白的分离纯化

2 表面蛋白的表面定位研究

3 乳酸杆菌粘附性表面蛋白的研究

第四节 本研究的目的、意义和内容

1 本研究的目的和意义

2 研究内容

第二章 仔猪肠道高粘附性乳酸杆菌的分离鉴定

第一节 乳酸杆菌的分离鉴定

1 材料与方法

2 试验结果

3 讨论

4 小结

第二节 高粘附性乳酸杆菌的筛选

1 材料与方法

2 试验结果

3 讨论

4 小结

第三节 高粘附乳酸杆菌的抗逆特性及其病原菌抑制能力

1 材料与方法

2 试验结果

3 讨论

4 小结

第三章 仔猪肠道高粘附性乳酸杆菌表面蛋白的功能分析

第一节 乳酸杆菌粘附性表面蛋白的分离鉴定与结构分析

1 材料与方法

2 试验结果

3 讨论

4 小结

第二节 乳酸杆菌表面蛋白在大肠杆菌中表达

1 材料与方法

2 试验结果

3 讨论

4 小结

第三节 乳酸杆菌表面蛋白功能分析及其细菌表面定位

1 材料与方法

2 试验结果

3 讨论

4 小结

第四章 高粘附性罗伊氏乳酸杆菌在小鼠及仔猪肠道内的定植分布及益生效应

第一节 高粘附性罗伊氏乳酸杆菌在小鼠肠道内的动力学分析

1 材料与方法

2 试验结果

3 讨论

4 小结

第二节 高粘附性罗伊氏乳酸杆菌在仔猪肠道内的定植与分布及益生效应

1 材料与方法

2 试验结果

3 讨论

4 小结

小结、创新点及后续研究展望

参考文献

博士期间发表论文情况

致谢