钙库操纵性钙内流抑制剂SKF-96365抗结肠癌作用及机制研究

摘要

结肠癌是临床上常见的消化系统恶性肿瘤，当前以外科手术与化疗为主的综合治疗效果仍不理想，治疗后仍有约50％以上的患者出现复发与转移。因此，寻找新的治疗靶点与治疗策略以进一步改善患者预后，是目前结肠癌治疗中亟需解决的问题。钙离子（Ca2+)作为重要的第二信使参与调节许多细胞基本生理功能，并与肿瘤的浸润、转移和血管生成等恶性表型密切相关。细胞内钙离子稳态的维持依靠细胞内钙库Ca2+的释放与细胞外Ca2+的内流。钙库操纵性Ca2+内流(store-operated calcium entr，SOCE)是Ca2+进入肿瘤细胞内的主要方式，靶向SOCE的抑制剂有望成为新的抗肿瘤药物。SKF-96365是钙库操纵性钙内流抑制剂，能够明显抑制非兴奋细胞中的SOCE过程。研究发现SKF-96365能够抑制多种肿瘤细胞的增殖。目前，SKF-96365在结肠癌中的抗肿瘤作用及其分子机制尚不清楚。
　　目的：
　　研究SKF-96365对结肠癌细胞的抗肿瘤作用，及对细胞周期、凋亡、自噬水平的影响;分析SKF-96365抗肿瘤作用可能的分子机制及自噬在此过程中所发挥的作用;在此基础上观察抑制自噬是否增加结肠癌细胞对SKF-96365的敏感性。
　　方法：
　　通过激光共聚焦显微镜观察SKF-96365对结肠癌细胞SOCE过程的影响;MTS检测SKF-96365对结肠癌细胞存活的影响;流式细胞仪、Western blot等方法观察SKF-96365对细胞周期和凋亡的影响;Western blot、免疫荧光与透射电镜等方法观察SKF-96365处理对结肠癌细胞自噬相关蛋白表达及自噬体形成的影响;抗体芯片及生物信息学分析SKF-96365处理后结肠癌细胞中重要信号通路的表达变化情况;MTS方法检测，自噬抑制剂或下调自噬调控基因Beclin1抑制自噬对SKF-96365抗肿瘤作用的影响;采用流式细胞仪检测抑制自噬前后细胞凋亡率的变化;建立结肠癌裸鼠移植瘤模型验证自噬抑制剂对SKF-96365的增敏作用。
　　结果：
　　SKF-96365能够抑制结肠癌细胞株SOCE介导的钙离子内流，并能有效抑制HCT116与HT29细胞生长，其机制在于诱导结肠癌细胞G2/M期阻滞和凋亡。同时，我们发现SKF-96365可以诱导结肠癌细胞自噬，并证实SKF-96365诱导的自噬先于凋亡发生。自噬通过抑制细胞色素c从线粒体的释放，从而延缓凋亡的发生，为细胞提供保护。
　　为进一步明确SKF-96365诱导结肠癌细胞凋亡及自噬的分子机制，我们采用抗体芯片检测SKF-96365作用前后细胞内主要信号传导通路的变化，发现SKF-96365能够显著抑制AKT/mTOR信号通路。结合生物信息学分析，我们预测并证实钙离子-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱγ亚型（CaMKⅡγ）在SKF-96365抗肿瘤过程中起到关键作用，其可以磷酸化AKT S473位点，进而激活AKT/mTOR信号通路。而AKT/mTOR信号通路在肿瘤增殖、凋亡及自噬过程中发挥了重要作用。过表达CaMKⅡγ或AKT1，可以减弱SKF-96365诱导的肠癌细胞自噬与凋亡水平。
　　体外研究表明，抑制自噬可以提高SKF-96365对结肠癌细胞的生长抑制作用。不同浓度的SKF-96365联合自噬抑制剂CQ或3-MA作用于HCT116和HT29细胞后，对其抑制作用显著高于SKF-96365单药组，(p＜0.001)。以siRNA Beclin1转染HCT116和HT29细胞，也能够显著提高肿瘤细胞对SKF-96365的敏感性。流式细胞仪检测结果显示与SKF-96365单药处理相比，联合CQ和3-MA时，细胞凋亡率显著增加(p＜0.05)，但对于SKF-96365诱导的G2/M期阻滞未见明显作用。
　　裸鼠移植瘤结果表明自噬抑制剂HCQ可以增加SKF-96365对HCT116移植瘤的抑制作用。SKF-96365联合HCQ组肿瘤体积较对照组缩小约48.4％，且未观察到明显毒性反应。与体外研究结果一致，Western blot与免疫组化检测发现，SKF-96365处理组微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达水平明显升高。SKF-96365联合HCQ组较SKF-96365单药组凋亡更为明显。同时我们进一步证实，SKF-96365抑制了肿瘤组织中CaMKⅡγ/AKT/mTOR信号通路的激活。
　　结论：
　　SKF-96365能够明显抑制结肠癌细胞SOCE介导的钙离子内流，从而抑制结肠癌细胞生长，其机制是通过抑制钙离子/CaMKⅡγ/AKT信号传导通路，导致细胞周期阻滞、凋亡与自噬。抑制自噬促进SKF-96365在体内外对结肠癌细胞的生长抑制作用，提高细胞凋亡率。SOCE抑制剂SKF-96365联合自噬抑制剂有可能成为结肠癌的一种新的治疗策略。

目录

声明

致谢

摘要

英文缩略词及中文对照

1 前言

2 实验材料

2．1 细胞株

2．2 动物饲养

2．3 主要药物、试剂及材料

2．4 仪器与设备

3 实验方法

3．1 细胞培养与传代

3．2 细胞计数

3．3 MTS分析

3．4 细胞免疫荧光

3．5 透射电镜

3．6 流式细胞术检测细胞凋亡

3．7 流式细胞术检测细胞周期

3．8 蛋白免疫印迹

3．9 siRNA转染

3．10 线粒体膜电位检测

3．11 质粒转染

3．12 细胞内SOCE测定

3．13 聚合酶链反应

3．14 平板克隆形成实验

3．15 抗体芯片检测

3．16 GEO生存数据分析

3．17 裸鼠移植瘤模型建立

3．18 数据的统计处理

4 实验结果

4．1 SKF-96365可以抑制结肠癌细胞SOCE过程，并抑制其生长

4．2 SKF-96365通过调控细胞周期蛋白引起结肠癌细胞G2／M期阻滞

4．3 SKF-96365诱导结肠癌细胞发生凋亡

4．4 SKF-96365诱导结肠癌细胞发生保护性自噬

4．5 抑制自噬促进SKF-96365体外抗肿瘤作用

4．6 SKF-96365抗结肠癌作用的分子机制

4．7 裸鼠移植瘤模型证实自噬抑制剂增加SKF-96365抗结肠癌作用

5 讨论

6 结论

7 存在的问题和下一步研究计划

参考文献

综述 SOCE与肿瘤研究进展

作者简历