人尿液来源的诱导多能干细胞定向分化为晶状体小体的新方法建立及在晶状体发育机制研究中的运用

摘要

目的:
　　白内障是全球最主要的致盲眼病之一，手术是目前唯一有效的治疗途径。随着我国老龄化的加剧，白内障手术的需求量每年大幅增加，由此给社会和家庭带来沉重负担。近期两个研究团队分别发现两个对白内障可能有治疗作用的药物，并在细胞以及动物模型上获得良好效果，由此为白内障的药物治疗打开新的思路，但由于人源的体外晶状体模型的缺乏，这类药物在人源上的验证未能实现。因此，本学位论文旨在利用人源诱导多能干细胞(h-iPSCs)定向分化获得人晶状体小体(LB)，构建合适的具有晶状体光学特性的体外晶状体模型并在此基础上进行晶状体发育机制研究。
　　方法:
　　首先收集分离人尿液中的上皮细胞，用慢病毒做载体将“Yamanaka四因子”转入尿液细胞将其重编程获得iPSCs，通过碱性磷酸酶染色、多能干细胞标志物（SOX2、SSEA-4、Nanog、TRA1-81、OCT4）的免疫荧光染色及RT-qPCR、拟胚体形成实验以及畸胎瘤实验验证iPSCs的多能性。
　　其次，我们创立了“荷包蛋法”将iPSCs诱导分化成成熟、具有光学特性的LB，通过免疫荧光染色及RT-qPCR检验LB分化过程的晶状体发育标志物(DLX3、SIX1、EYA1、PAX6、CRYAA、CRYAB、PROX1、FOXE3、SOX1、CRYB、CRYGC、MIP)的动态表达，验证LB分化过程和晶状体胚胎发育的对应性，用透射电镜和亚甲蓝染色等检测成熟LB的细微结构验证其与晶状体的相似性，通过“X”实验检测成熟LB的光学特性（透明度以及放大倍率）。
　　最后通过基因芯片检测iPSCs和LB中mRNA和lncRNA的差异表达，用RT-qPCR对部分自噬相关基因及其对应lncRNA、晶状体发育相关基因及其对应lncRNA进行验证并从中筛选出lncRNA p10540做进一步功能研究。利用siRNA沉默lncRNA p10540表达，同时检测LC3B在mRNA和蛋白水平的表达变化。通过对老年性患者以年龄分组并提取其囊膜RNA检测lncRNA p10540和老年性白内障的相关性。
　　结果:
　　我们利用人尿液来源的上皮细胞成功重编程获得iPSCs，该iPSCs磷酸酶染色呈强阳性、表达多能干细胞标志物、能形成完美的拟胚体，将其注射入裸鼠中可获得有三个胚层组织和细胞的畸胎瘤。
　　通过“荷包蛋法”诱导iPSCs可获得成熟LB，其分化过程有晶状体板期、早期晶状体期及成熟晶状体期，与晶状体胚胎发育一一对应。成熟LB表达晶状体纤维细胞标志物（CRYAA、CRYAB、CRYB、CRYGC、MIP），具有晶状体上皮细胞、晶状体纤维细胞以及囊膜等结构，且具有良好的透明性和1.7倍的放大倍率。
　　自噬存在于LB分化过程中，该现象与小鼠晶状体胚胎发育相似。基因芯片结果提示自噬基因相对应lncRNA在LB分化过程中的差异表达，lncRNA p10540在LB分化过程中通过在细胞胞浆中增强LC3B向活化状态LC3BⅡ的转化而影响自噬作用，此外在年龄＞75岁组中lncRNAp10540的表达明显下降。
　　结论:
　　人尿液来源的上皮细胞可以作为iPSCs构建的理想体细胞来源。利用“荷包蛋法”可将iPSCs分化成立体、直径可达3mm且具有光学特性的LB，是目前已知的最接近人晶状体的理想体外晶状体模型。自噬以及lncRNA在LB分化过程中具有重要作用，lncRNA p10540通过影响LC3B的活化影响自噬进而可能影响LB分化发育且其与老年性白内障发病相关。

目录

声明

致谢

摘要

中英文略缩词对照表

材料、试剂和仪器

绪论

第一部分 人尿液细胞来源的诱导多能干细胞的构建

前言

1 实验方法

2 实验结果

第二节 人尿液细胞来源的iPSCs的建立

1 实验方法

2 实验结果

1 实验方法

2 实验结果

讨论

结论

第二部分 人iPSCs体外定向分化为晶状体小体的构建

前言

1 实验方法

2 实验结果

第二节 “荷包蛋法”和传统“三步法”对比

1 实验方法

2 实验结果

1 实验方法

2 实验结果

第四节 成熟LB细微结构及光学特性检测

1 实验方法

2 实验结果

讨论

结论

第三部分 通过LB模型对人晶状体发育过程中自噬及其相关lncRNA作用的研究

前言

第一节 LB分化过程中具有与在体晶状体发育相似的自噬现象

1 实验方法

2 实验结果

第二节 LB中基因表达谱以及lncRNA表达谱的检测及验证

1 实验方法

2 实验结果

第三节 自噬或晶状体发育相关基因及其对应lncRNA在LB分化过程中的表达

1 实验方法

2 实验结果

第四节 lncRNA p10540的表达确认及功能研究

1 实验方法

2 实验结果

第五节 lncRNA p10540与老年性白内障的相关性

1 实验方法

2 实验结果

讨论

结论

全文总结及展望

参考文献

综述 基于诱导多能干细胞的疾病模型构建在眼科学的应用及其技术新进展

个人简历及在读期间所取得的科研成果