胶质瘤中皮层肌动蛋白表达和其在胶质瘤细胞运动中的作用的研究

摘要

胶质瘤作为最常见的颅内原发肿瘤，约占成人全身肿瘤的2％。统计表明其中的一半以上是最高度恶性胶质瘤-胶质母细胞瘤(GBM)，其以侵袭性生长，微卫星灶，或散在肿瘤细胞的形式浸润于周围正常脑实质著称，是人类难治性肿瘤之一[1-5]。尽管手术切除及术后辅助同步放化疗方案应用于胶质母细胞瘤患者取得了一定效果，但多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)患者的五年生存率仍然不到10％，对于老年的患者来说生存率更低[6-10]。
　　肌动蛋白成核促进因子之一的皮层肌动蛋白被证明不仅仅是肌动蛋白骨架动力学的调节因子，也是癌症侵袭过程中的重要一员。皮层肌动蛋白作为一多结构域蛋白，其氨基末端为酸性结构域、接着是六个半的重复序列、α螺旋、富含脯氨酸的片段、最后是羧基端的SH3区域。皮层肌动蛋白最开始被认为是非受体酪氨酸激酶重要的作用底物。从那时起，越来越多的研究表明，皮层肌动蛋白在肿瘤的浸润和发展中起到了重要作用。过去十年中，众多关于皮层肌动蛋白的研究着重于其在肿瘤细胞运动中所起的作用。皮层肌动蛋白作为一多结构域的调节蛋白，其可以通过多种方式调节肌动蛋白的聚合、解聚并可以进一步影响细胞的“运动器官”-片状伪足的形成、维持[11]。皮层肌动蛋白N末端序列可以直接与Arp2/3复合体(Arp2/3 complex)结合而调节肌动蛋白丝的聚合、解聚，其还可以通过其结构域:Src同源结构域3(SH3)与神经奥尔德里奇综合征复合体(N-WASP)等的结合而调节上述过程[12]。以往的研究表明，该蛋白在乳腺癌、头颈部肿瘤、前列腺癌等肿瘤中过表达并与预后不良密切相关[13-15]，而其在胶质瘤中的表达及其与胶质瘤细胞运动的关系仍未被证实。
　　本课题主要研究皮层肌动蛋白在胶质瘤中的表达和其调节胶质瘤细胞迁移、侵袭及其可能机制的研究，分为以下三个部分:
　　1.皮层肌动蛋白在人胶质瘤中的表达情况。为探讨皮层肌动蛋白在胶质瘤中的表达情况，我们收集了40例不同病理级别的胶质瘤标本以及8例颞叶癫痫手术中获得的非肿瘤脑组织。本课题在实验过程中，首先采用免疫组化检测不同标本中皮层肌动蛋白的表达情况，结果显示，皮层肌动蛋白在非肿瘤脑组织中表达呈弱阳性，而在胶质瘤组织标本中表达强度明显增强并且其染色强度随着肿瘤级别的增高而增强(F=41.160，P=0.000)。
　　Western blotting结果显示对照脑组织当中皮层肌动蛋白表达量为18.20±2.52％(n=8)，WHOⅡ级胶质瘤标本中表达量为36.20±3.34％(n=15)，WHOⅢ级胶质瘤标本中表达量为51.40±4.30％(n=9)，WHOⅣ级胶质瘤标本中表达量为59.60±4.31％(n=16)。数据分析显示，胶质瘤中皮层肌动蛋白表达量高于对照脑组织(P＜0.01)，并且皮层肌动蛋白表达量与胶质瘤的病理级别呈正相关(r=0.912, P=0.00)。
　　2.皮层肌动蛋白在胶质瘤细胞迁移和侵袭中的作用。我们选择人胶质瘤细胞系U251、SNB19和LN229进行体外研究，分为三组，siRNA-cortactin组（转入特异性干扰RNA）、siRNA-NC组（转入阴性对照RNA序列）及siRNA-N组（转入空载体）。QRT-PCR及Western blotting检测皮层肌动蛋白表达的下调，体外划痕实验和Transwell侵袭实验检测细胞的迁移和侵袭能力。结果:皮层肌动蛋白表达被明显抑制，抑制后胶质瘤细胞的迁移侵袭能力明显下降(P＜0.05)。
　　3.皮层肌动蛋白促进胶质瘤细胞迁移和侵袭的可能机制。免疫荧光观察皮层肌动蛋白表达抑制后胶质瘤细胞片状伪足的变化。免疫荧光法验证皮层肌动蛋白与Arp2/3复合体在胶质瘤细胞内的定位。免疫共沉淀(Co-IP)实验验证两者在细胞内的结合。结果:抑制皮层肌动蛋白表达后，胶质瘤细胞片状伪足减小且持续时间缩短。免疫荧光显示皮层肌动蛋白与Arp2/3复合体共定位于胶质瘤细胞内片状伪足形成的富含肌动蛋白的区域。免疫共沉淀结果显示二者在细胞内存在结合状态。
　　结论:
　　1.皮层肌动蛋白在胶质瘤组织中表达较对照脑组织明显升高，并且表达水平与胶质瘤的病理级别呈正相关。
　　2.特异性干扰RNA抑制皮层肌动蛋白表达后胶质瘤细胞迁移、侵袭能力明显下降。
　　3.皮层肌动蛋白表达被抑制后，胶质瘤细胞片状伪足形成减少，持续时间缩短。皮层肌动蛋白与Arp2/3复合体共定位于细胞内富于肌动蛋白的区域。免疫共沉淀显示两者在细胞内相结合。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、皮层肌动蛋白在不同级别胶质瘤中的表达情况

1．1 对象和方法

1．1．1 病例资料

1．1．2 主要实验试剂与仪器

1．1．3 实验方法

1．1．4 统计学方法

1．2 结果

1．3 讨论

1．4 小结

二、皮层肌动蛋白在胶质瘤细胞迁移和侵袭中的作用

2．1 对象和方法

2．1．1 主要实验试剂与仪器

2．1．2 细胞培养及实验分组

2．1．3 转染

2．1．4 细胞总蛋白的提取

2．1．5 Western blotting检测皮层肌动蛋白的表达

2．1．6 RNA的提取

2．1．7 逆转录酶-多聚酶链反应(reverse transriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)

2．1．8 Transwell细胞侵袭实验

2．1．9 细胞迂移实验

2．1．10 统计学方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 小结

三、皮层肌动蛋白促进胶质瘤细胞迁移和侵袭的可能机制

3．1 对象和方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述 皮层肌动蛋白的分子结构特征及其在细胞运动中的作用

致谢