抑制性寡核苷酸诱导致耐受性浆细胞样树突状细胞治疗实验性自身免疫性神经炎的实验研究

摘要

研究目的：
　　吉兰-巴雷综合征是神经系统发病率相对较高、致残疾相对较重的自身免疫性疾病，目前发病机制尚未十分明确。一般认为，机体免疫稳态的破坏始动吉兰-巴雷综合症的发生并参与了疾病发展过程。研究吉兰-巴雷综合征患者免疫耐受失衡的具体机制，将有助于了解吉兰-巴雷综合征及其它自身免疫性疾病的发病机制，并能够为这些现有治疗方法不佳的自身免疫性疾病的治疗提供更好的临床干预方法。实验性自身免疫性神经炎(Experimental autoimmune neuritis, EAN)是 CD4+T细胞介导的周围神经系统自身免疫性疾病，通过利用优势肽段 P0或P2加完全弗氏佐剂主动免疫易感动物而建立，是研究吉-兰巴雷综合征的经典动物模型，广泛用于针对吉兰-巴雷综合征发病机制及治疗策略的研究中。树突状细胞是体内功能最强的抗原提呈细胞，浆细胞样树突状细胞是其亚群之一，能够通过自身表达的固有免疫受体——Toll样受体9(Toll like receptors9, TLR9)识别抗原而活化，进而发挥介导免疫反应或调解免疫耐受的作用。研究表明TLR9主要识别的配体为寡聚脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODN)，包括刺激性(CpG ODN)和抑制性(sODN)两类。目前已证实浆细胞样树突状细胞经TLR9识别不同ODN可以启动或抑制Th1型免疫反应。既往研究发现，EAN中 TLR9的表达上升。既往曾有尝试应用sODN缓解类风湿关节炎模型病情的研究报道。因此在本实验中，我们设定不同ODN干预培养浆细胞样树突状细胞的分组，通过荧光定量PCR检测共刺激分子mRNA的表达；通过蛋白免疫印迹法检测相关通路上关键蛋白的表达；利用酶联免疫法测定浆细胞样树突状细胞分泌的炎性因子量的表达变化，同时尝试应用这些预干预细胞对实验性自身免疫性神经炎进行干预并观察其行为学变化情况，旨在探究 sODN能否诱导致耐受浆细胞样树突状细胞的产生及其可能机制，并探究 sODN诱导的浆细胞样树突状细胞能否促进实验性自身免疫性神经炎临床症状的恢复，从而为临床寻找新的有效治疗吉兰-巴雷综合征的方法提供理论支持。
　　研究方法：
　　本实验包括体内、体外实验两部分，其中体外实验部分如下：健康6-8W的雄性C57BL/6小鼠，在无菌条件下分离脾脏，采用免疫磁珠分选法获得脾脏浆细胞样树突状细胞，流式细胞计数检测所得浆细胞样树突状细胞纯度。将所得细胞按照0.5×10^5/孔种植于24孔板中，分别设为空白组、P0180-199组、P0180-199+CpG ODN组、P0180-199+sODN组、P0180-199+control ODN(cODN)组。加入10％FBS-1640培养基，培养48小时后提取mRNA及蛋白并收集上清。利用荧光定量PCR检测各组CD40、CD80、CD86和IDO的mRNA表达水平变化，利用蛋白免疫印迹法检测各组 TLR9、MyD88、 NF-κB p65、ERK/p-ERK、p38/p-p38、JNK/p-JNK、Akt/p-Akt、PI3K蛋白表达水平变化。利用酶联免疫吸附试验检测各组 IL-12、IL-6、IL-4和TNF-ɑ的表达水平变化。体内实验部分：采用 P0180-199肽段联合完全弗氏佐剂制备抗原乳剂，通过免疫 C57BL/6小鼠双足足垫建立实验性自身免疫性神经炎动物模型。在免疫后第10天，将模型随机分为空白对照组、CpG ODN组、sODN组和cODN组，对后三组模型分别尾静脉注射已分别预干预培养48h的浆细胞样树突状细胞，剂量为4×10^5细胞/0.1 ml/每只小鼠（n=6,每组）。每日进行评分以评估各组模型的临床症状恢复程度直至免疫后28天。比较28天时各组死亡率情况，比较28天时各组临床缓解（临床评分≤0.5分）情况。
　　研究结果：
　　1.流式抗体标记经免疫磁珠法分选所得细胞，采用流式细胞法检测分离细胞纯度。3次重复流式检测结果显示所得浆细胞样树突状细胞比例为90-93%，所得纯度能够支持后续实验研究。
　　2.蛋白免疫印迹结果显示同空白组相比，P0180-199组 TLR9及 NF-κB p65的表达水平升高，而相比较P0180-199组，P0180-199+CpG ODN组TLR9及NF-κB p65的表达量明显增加，P0180-199+sODN组TLR9及NF-κB p65表达量则明显下降。各组间 ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-38、Akt、p-Akt表达量无明显差异。相比较空白组，P0180-199组及P0180-199+CpG ODN组MyD88的表达量明显增加，但P0180-199组及P0180-199+CpG ODN组两组间MyD88表达量无明显差异， p=0.76，而P0180-199+sODN组同P0180-199+CpG ODN组相比MyD88表达量则减少。以上结果均有统计学意义，p<0.001。
　　3.荧光定量PCR检测结果显示相比空白组，P0180-199组CD40、 CD80和CD86的mRNAs表达水平升高。相比P0180-199组，P0180-199+CpG ODN组CD40、CD80和CD86 mRNA的表达量明显增高，而P0180-199+sODN组 CD40、 CD86的 mRNAs表达量减少；另一方面IDO mRNA检测结果显示，P0180-199+sODN组 IDO的 mRNA水平则显著高于其它各组，且相比空白组差异具有统计学意义；而相比空白组， P0180-199组中 IDO的 mRNA表达水平则出现下降，而P0180-199+CpG ODN组同P0180-199组相比IDO的mRNA表达量则明显减少，以上结果均有统计学意义，p<0.001。
　　4.酶联免疫吸附试验检测结果表明相比空白组，P0180-199组上清中细胞因子IL-12p40、IL-6和TNF-α的表达水平均增高，同P0180-199组相比，P0180-199+CpG ODN组各因子水平增高显著；而同 P0180-199组相比，P0180-199+sODN组细胞分泌的 IL-12p40、IL-6和 TNF-α水平显著降低，以上结果均有统计学意义， p<0.001。
　　5.行为学观察结果显示自免疫后第7日起，各组小鼠最先可出现精神不振等非特异性性表现，在免疫第9天后各组小鼠均开始发病，出现尾部无力，活动受限等临床表现。整个病程呈单相病程，除 sODN组外各组发病高峰多集中在17天左右，而sODN组发病高峰在14天左右。观察结果显示CpG ODN组中第16天、第17天分别出现1只、3只小鼠死亡，至28天时CpG ODN组共有四只小鼠死亡。生存曲线结果显示相比EAN组，CpG ODN组的生存率明显下降(p=0.02);而sODN及cODN组生存率同EAN组比较无明显差异。每日临床评分结果显示，sODN组评分呈现出早期下降且高分减低的特点，相比较 EAN组，sODN组评分降低具有统计学差异(p<0.05)。统计学结果显示免疫28天后sODN组模型临床缓解（评分<0.5或者更低）的比例要高于EAN组，p＜0.001。结论：
　　（1）TLR9调控pDCs发挥促炎作用参与EAN的发病过程。
　　（2）sODN能够通过TLR9/NF-κB通路诱导致耐受性浆细胞样树突状细胞的产生。
　　（3）sODN诱导的浆细胞样树突状细胞能够减轻EAN小鼠临床症状，缓解疾病的严重程度。以TLR9抑制剂如sODN为干预靶点可以为未来吉兰-巴雷综合征及相关自身免疫性疾病的治疗提供新方向。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

1对象和方法

1.1 研究对象

1.2主要仪器

1.3主要实验试剂

1.4主要溶液及试剂配方

1.5实验方法

1.6统计分析

2结果

2.1流式细胞学检测分离细胞中pDCs的纯度

2.2 Western blot 检测TLR9、NF-κB p65及MyD88的含量

2.3 qPCR检测CD40、 CD80 、CD86和IDO mRNA的表达水平

2.4 ELISA法检测IL-12p40、IL-4、IL-6 和TNF-α的含量

2.5行为学观察

3讨论

3.1 pDCs与EAN的关系

3.2 sODN与致耐受性浆细胞样树突状细胞

3.3 sODN对EAN的影响

小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: 浆细胞样树突状细胞与自身免疫性疾病

致谢

个人简历