葡萄球菌肠毒素对猪T、APC细胞免疫突触分子表达的影响

摘要

葡萄球菌肠毒素（staphylococcal enterotoxins，SEs）是由葡萄球菌产生的一类结构、功能相似蛋白质家族。葡萄球菌肠毒素主要通过其超抗原活性促使大量T细胞活化并释放炎症因子，而免疫突触的形成是T细胞活化、细胞因子风暴产生及肠毒素超抗原活性发挥的基础。因此，本研究主要聚焦于参与肠毒素超抗原活性发挥的抗原提呈细胞——肺泡巨噬细胞及 T细胞上的免疫突触相关分子的变化，探讨不同肠毒素对免疫突触形成的影响。
　　（1）主要免疫突触分子的克隆及分析：从猪 PBMC和猪肺泡巨噬细胞3D4/21上PCR扩增3种免疫分子sMHCⅠ，sMHCⅡ(3D4/21)和sCD4(PBMC)，回收目的片段克隆到pEASY-T1克隆载体或pEASY-blunt克隆载体。测序结果表明，3种分子基因序列与 NCBI/GeneBank已登录序列同源性在99％以上。编码氨基酸序列一级结构预测表明，sMHCⅠ、sMHCⅡ和 sCD4均含跨膜区，胞外区均含有Ig结构域。对3种分子的磷酸化位点，糖基化位点以及抗原决定簇预测，有助于其信号转导研究。
　　（2）主要免疫突触分子的表达及抗体制备：首先诱导表达纯化 CD28和MHCⅡ蛋白，之后免疫兔子制备多克隆抗体。利用间接 ELISA检测 CD28和MHCⅡ多克隆抗体效价分别为1:3200和1:6400。Western blot结果表明重组蛋白制备的抗体与细胞上相关免疫分子具有良好的反应性。
　　（3）不同肠毒素对免疫突触形成的影响：设计免疫突触相关分子 MHCⅠ-CD8，MHCⅡ-CD4，CD80/CD86-CD28/CTLA-4，ICAM-1-LFA-1的特异性检测引物，应用 qPCR技术检测不同肠毒素体外刺激 PBMC，3D4/21后这些分子的转录表达变化。结果表明，不同肠毒素刺激 PBMC及 PBMC+3D4/21共培养体系，可上调以上免疫突触分子的转录，促进免疫突触形成，有助于T、APC细胞间的互作及T细胞活化；粘附分子ICAM-1在24 h时转录水平较高，在免疫突触形成的早期有助于TCR识别特异性抗原；负调控分子CTLA-4在72 h转录水平最高有助于抑制T细胞的过度活化增殖。
　　不同肠毒素刺激猪肠道组织5h免疫突触分子转录上调，可能因为大量炎症细胞及T细胞迁移到肠道，特别是MHCⅡ转录上调有助于肠毒素超抗原提呈。
　　对sMHCⅡ-sCD4，sTCR-SEs-sMHCⅡ同源模建，预测分子界面作用力，分析核心免疫突触分子对肠毒素超抗原活性的影响。结果表明：猪 sCD4分子与sMHCⅡ间存在作用力（氢键和盐桥），可促进 T及 APC细胞间的识别；肠毒素SEA、SEK、SEQ分别与克隆到的不同TCRVβ形成识别界面且作用力不同，不同肠毒素与TCRVβ结合稳定性存在差异。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 葡萄球菌及其肠毒素简介

1.2 葡萄球菌肠毒素超抗原活性

1.3 免疫突触结构及信号转导

1.4 本课题研究目的及意义

第二章 猪免疫细胞表面主要免疫突触分子的克隆及分析

2.1 引言

2.2 实验材料与方法

2.3结果与分析

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 猪免疫细胞表面主要免疫突触分子表达及抗体制备

3.1 引言

3.2 实验材料与方法

3.3结果与分析

3.4讨论

3.5 小结

第四章 葡萄球菌肠毒素对免疫突触形成的影响

4.1 引言

4.2 实验材料与方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

4.5 小结

第五章 结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

致谢