真核生物细胞有丝分裂的分子生物学机制研究

摘要

在细胞有丝分裂过程中，组蛋白H3尾部(氨基末端)的磷酸化作用是发生在细胞有丝分裂过程中的特征性事件。为了研究组蛋白的氨基末端磷酸化过程与有丝分裂的关系，在本学位论文研究中，使用了同步化技术、免疫荧光标记技术、激光共聚焦技术、IP(免疫沉淀技术)、co-IP(免疫共沉淀)技术、SDS-PAGE、 westem blot技术和CHIP(核小体免疫沉淀)技术，研究组蛋白H3磷酸化修饰在细胞有丝分裂过程中的作用。确定10位点丝氨酸残基磷酸化组蛋白H3(ser-10pH3)和7位点丝氨酸残基磷酸化CENP-A(ser-7 pCENP-A)在中体上的定位；检测ser10、ser28、thr3、thr11以及H3的变体蛋白CENP-A在细胞有丝分裂过程中出现的顺序；确定在有丝分裂期Ser-10位点磷酸化的组蛋白H3定位对应的DNA序列，进一步研究组蛋白H3各点磷酸化作用在细胞有丝分裂中的生物学功能。 研究结果表明，在细胞有丝分裂过程中，Ser-7 pCENP-A大量出现的时间要晚于Ser-10 pH3在有丝分裂过程中大量出现的时间。并且ser-10 pH3和ser-7pCENP-A在有丝分裂前期、中期在染色体上的分布是不一样的，ser-7 pCENP-A集中在着丝粒的外周，sot-10 pH3先是在整条染色体上分布，然后集中在端粒部分。在有丝分裂后期，这两种蛋白都转移到细胞中心纺锤体的位置，最后随着压缩环的组建和收缩，set-10 pH3和ser-7 pCENP-A都被挤压定位在中体位置。分离提取中体并对中体成分进行分析，结果表明，这两种蛋白质确实是中体的组成成分。Ser-10 pH3和ser-7 pCENP-A这两种蛋白质的动态分布十分相似，但是他们却不属于同一种蛋白复合物，通过co-IP实验证明，ser-10 pH3属于染色体过客蛋白复合物而ser-7 pCENP-A却不属于这种复合物。上述实验结果证明ser-10 pH3和ser-7 pCENP-A既参与了细胞的有丝分裂又参与了细胞的胞质分裂，同一种蛋白质参与了两个不同的过程，这事实提示核分裂和胞质分裂是两个连续的过程，胞质分裂发生在核分裂之前，这两种蛋白质N-末端的磷酸化可能的功能是改变蛋白质和DNA的亲和力，使它们改变核定位进入胞质组成中体帮助细胞完成胞质分裂。 在细胞有丝分裂过程中组蛋白H3的N-末端存在四个磷酸化位点，它们分别为ser10、set28、thr3、thr11。通过细胞同步化实验结果显示：ser10、set28、 thr11均在细胞有丝分裂早期大量出现，ser10和thr11几乎同时在细胞中大量出现，set28的出现时间要晚于ser10和thr11的出现时间。而thr3则在整个细胞分裂过程中均可以通过werstem blot技术检测到。这四种磷酸化作用出现的时间很可能与它们在细胞生长过程中所执行的功能是相对应的。另外，通过间接免疫荧光染色及共聚焦显微镜观察发现，ser-10 pH3在染色体上的定位似乎集中在端粒位置，为了进一步证实这个实验结果，我们利用CHIP技术检测ser-10 pH3所对应的DNA序列，结果显示，ser-10 pH3确实在端粒部位分布。 为了验证set-10 pH3在真核细胞中所执行的功能是否存在一定的保守性，我们用间接免疫荧光标记技术检测了Set-10 pH3在小麦根尖细胞有丝分裂过程中的动态分布。结果显示在小麦根尖细胞中，Ser-10 pH3在染色体上出现和消失也同染色体的凝集和解凝集过程存在一定的时间和空间的相关性，这说明在小麦根尖细胞中这种翻译后修饰作用也是与染色体凝集相关的。另外我们发现在细胞根尖细胞有丝分裂过程中，微管的分布也是呈有规则的动态变化的。在细胞有丝分裂早前期，微管形成了预前期带(preprophase band)，在有丝分裂中期，微管平行的成束垂直排列在细胞赤道板的两侧，这些微管的平行排列帮助建立植物细胞有丝分裂的两极。有丝分裂后期，微管形成纺锤体微管结构，最后在细胞有丝分裂末期，微管形成成膜体微观定位在两个分裂的染色体中间部位。 研究事实表明，在动植物细胞中，Ser-10 pH3的功能是保守的，都与细胞有丝分裂过程中染色体的凝集相关；在动物细胞中组蛋白H3和CENP-A虽然都是核小体的组成成分，但是它们的N-末端发生磷酸化作用后都从核小体上脱落下来，可能是磷酸化导致H3和CENP-A的负电荷增加，因而增加与DNA的斥力，导致它们与DNA解离，为染色质重构和凝集提供了条件。这个推测尚待进一步证实。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章引言

第一节真核生物有丝分裂的过程

第二节动物细胞胞质分裂的分子基础

第三节染色体的结构与功能

第四节组蛋白N末端(尾部)修饰和“组蛋白密码”

第五节组蛋白H3的磷酸化作用

第六节着丝粒和CENP-A蛋白

第七节染色体过客蛋白复合物

本研究的目的和意义

第二章材料方法

第一节实验材料

第二节实验原理与方法

第三章结果与分析

第一节Ser-10 pH3和ser-7 pCENP-A在有丝分裂过程中出现的顺序

第二节Ser-10 pH3和ser-7 pCENP-A在细胞有丝分裂末期定位在中体并参与胞质分裂

第三节核小体免疫沉淀分析ser-10 pH3在核小体上结合的DNA序列

第四节组蛋白H3 N-末端的四种磷酸化作用出现的先后顺序

第五节Ser-10 pH3在小麦根尖细胞中的动态分布

第四章结论

参考文献

致谢

附录

个人简历