血清1型鸭疫里默氏菌OmpA/MotB蛋白免疫原性初探

摘要

鸭疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer, RA）感染鸭引起的鸭传染性浆膜炎是目前危害养鸭业最为严重的传染病之一，其中1型RA是流行最为广泛的血清型。为探究OmpA/MotB蛋白的免疫原性，本文对血清型1型RA的OmpA/MotB基因进行了生物信息学分析、原核表达及其蛋白纯化、基于OmpA/MotB蛋白的间接ELISA方法建立、免疫保护效果的检测等方面的研究，获如下结果:
　　1.OmpA/MotB基因核酸序列及其蛋白的生物信息学分析
　　经生物信息学软件分析及预测，OmpA/MotB基因片段长1467bp，整体为一个开放阅读框，无连续的2个及其以上的稀有密码子串。OmpA/MotB蛋白编码488个氨基酸，有OMP_b-brl亚族，OmpA_C-like亚族，OmpA三个保守区。第1-21号氨基酸残基为信号肽;无跨膜区，有利于原核表达;亲水，为可溶性蛋白;抗原表位集中于第127号-470号氨基酸之间（即第379bp-1410bp范围）;亚细胞定位于细胞外膜;功能分析可能是一种受体(Receptor)和生长因子(Growth factor)，可参与应激反应(Stress response)。
　　2.OmpA/MotB蛋白的原核表达、纯化及免疫印迹
　　根据OmpA/MotB的基因序列设计两对引物P1P2和P3P4，提取RA血清1型基因组，PCR扩增分别获得OmpA/MotB基因去信号肽片段及主要抗原表位区段，克隆至PMD19-T载体，鉴定正确后，再分别亚克隆至PGEX-4T-1，pET-32(a)+表达载体，成功构建重组表达质粒PGEX-4T-1/OmpA/MotB去信号肽及pET-32(a)+/OmpA/MotB主要抗原区。获得OmpA/MotB去信号肽蛋白的最佳表达条件为0.4mmol/L IPTG30℃诱导12h，表达蛋白的分子量为76kD，可经SDS-PAGE切胶的方式纯化;OmpA/MotB主要抗原表位区蛋白的最佳表达条件为1.2mmol/LIPTG37℃诱导12h，表达蛋白的分子量为56kD，通过Ni2+-NTA琼脂糖凝胶亲和层析得以纯化。表达的两种蛋白经SDS-PAGE及免疫印迹证实能够被兔抗RA血清1型抗体识别。
　　3.基于OmpA/MotB去信号肽蛋白、OmpA/MotB主要抗原表位区蛋白间接ELISA方法的建立
　　以OmpA/MotB去信号肽蛋白为包被抗原的ELISA最佳检测条件为以3.61μg/mL的蛋白浓度4℃包被过夜，以5％脱脂奶粉作为封闭液37℃封闭1h，血清1∶320稀释于37℃孵育2h，HRP标记的羊抗鸭IgG以1∶800稀释，于37℃孵育0.5h，显色10min为最佳检测条件，确定阳性阈值为0.15。
　　以OmpA/MotB主要抗原表位区蛋白为为包被抗原的ELISA抗体检测最佳条件为以2.9μg/mL蛋白浓度37℃孵育3h后4℃包被过夜，以1％脱脂奶粉37℃封闭2h，血清1∶160稀释于37℃孵育0.5h，HRP标记的羊抗鸭IgG以1∶1600稀释于37℃孵育0.5h，显色25min，确定阳性阈值为0.12。
　　建立的两种ELISA方法具有良好的特异性、重复性及灵敏度。
　　4.OmpA/MotB蛋白对雏鸭的免疫原性测定
　　将纯化的OmpA/MotB去信号肽蛋白及其主要抗原表位区蛋白分别与弗氏完全佐剂等量混合后免疫2日龄樱桃谷肉鸭，同时设置商品疫苗组每只鸭注射1羽份疫苗，空白对照组注射0.5mL生理盐水。于给定日龄采血，测定OmpA/MotB去信号肽蛋白、OmpA/MotB主要抗原表位区蛋白、血清型1型RA全菌超声裂解蛋白ELISA抗体水平，以及IL-4、IFN-γ、CD4+、CD8+4种免疫水平指标。于16日龄攻毒，23日龄时将存活的雏鸭处死。解剖一周内发病死亡的雏鸭及未死鸭，取脑、肝脏、心脏组织进行细菌分离。结果表明:OmpA/MotB去信号肽蛋白、OmpA/MotB主要抗原表位区蛋白对血清1型RA的攻击有一定的免疫保护作用，能刺激机体产生高水平抗体及一定水平细胞因子。表明血清1型RA OmpA/MotB蛋白具有良好的免疫原性，能同时刺激机体产生体液免疫与细胞免疫。

目录

声明

摘要

缩略词及符号说明表

一、引言

1．鸭疫里默氏菌概述

1．1 鸭疫里默氏菌简介

1．2 病原学研究

1．3 流行病学

1．4 临床症状和病理变化

1．5 诊断

2．鸭疫里默氏菌的分子生物学研究概况

2．1 RA毒力相关基因

2．2 RA的免疫蛋白

2．3 RA的亚单位疫苗

3．鸭疫里默氏菌外膜蛋白OmpA以及OmpA／MotB的研究

3．1 RA外膜蛋白A的研究

3．2 RA凝血酶敏感Ⅲ型重复蛋白(Thrombospondin type 3 repeats)：OmpA／MotB的研究

4．研究目的和意义

二、试验研究

1 试验材料

1．1 菌株、菌种及试验动物

1．2 主要试剂及耗材

1．3 血清、疫苗、试剂盒

1．4 主要仪器设备

2．方法

2．1 OmpA／MotB基因生物信息学分析

2．2 OmpA／MotB去信号肽及主要抗原表位区段原核表达及纯化

2．3 基于OmpA／MotB去信号肽蛋白、主要抗原表位区蛋白间接ELISA方法的建立

2．4 OmpA／MotB蛋白对雏鸭的免疫保护效果研究

3 结果

3．1 OmpA／MotB基因的生物信息学分析

3．2 RA-CH-1 OmpA／MotB去信号肽及其主要抗原表位区段的克隆和原核表达及纯化

3．3 基于OmpA／MotB去信号肽蛋白、主要抗原表位区蛋白间接ELISA方法建立

3．4 OmpA／MotB蛋白对雏鸭的免疫保护效果研究

4 小结

4．1 OmpA／MotB基因及OmpA／MotB蛋白生物信息学分析

4．2 RA-CH-1 OmpA／MotB去信号肽及其主要抗原表位区段的克隆和原核表达及表达蛋白的纯化

4．3 基于OmpA／MotB去信号肽蛋白、主要抗原表位区蛋白间接ELISA方法建立

4．4 OmpA／MotB蛋白对雏鸭的免疫保护效果研究

5 讨论

5．1 OmpA／MotB基因生物信息学分析

5．2 OmpA／MotB去信号肽、主要抗原表位区段的原核表达与纯化

5．3 基于OmpA／MotB去信号肽蛋白、主要抗原表位区蛋白间接ELISA方法建立

5．4 OmpA／MotB蛋白诱导的免疫鸭产生的ELISA抗体及其意义

5．5 OmpA／MotB蛋白诱导的免疫鸭产生的细胞因子及其意义

5．6 OmpA／MotB蛋白对雏鸭的免疫保护率

三、结论

参考文献

致谢