超声和微泡介导的生物可降解纳米粒PC-3细胞内递送siRNAs的实验研究

摘要

目的：通过超声和微泡介导自行设计的生物可降解三嵌段共聚物聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸-聚左旋赖氨酸(mPEG-PLGA-PLL)和聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸一聚左旋赖氨酸-RGD环肽(mPEG-PLGA-PLL-cRGD)包裹分子探针Cy3标记的siRNAs的体外实验研究，探讨超声和微泡的物理方法与生物可降解纳米粒的载体方法联合应用时，PC-3细胞的siRNAs递送效果及可能的机制，探索增强基因递送效果的新途径。
　　 方法：
　　 1.mPEG-PLGA-PLL/siRNA和mPEG-PLGA-PLL-cRGD/siRNA纳米粒的制备以三嵌段共聚物mPEG-PLGA-PLL和mPEG-PLGA-PLL-cRGD为载体，分别包裹分子探针Cy3标记的siRNAs，制备成非RGD载基因纳米粒mPEG-PLGA-PLL/siRNA和RGD载基因纳米粒mPEG-PLGA-PLL-cRGD/siRNA。
　　 2.mPEG-PLGA-PLL/siRNA和口mPEG-PLGA-PLL-cRGD/siRNA纳米粒表征用电位/超细微粒粒度分析仪和原子力显微镜对所构建的非RGD载基因纳米粒mPEG-PLGA-PLL/siRNA和RGD载基因纳米粒mPEG-PLGA-PLL-cRGD/siRNA进行表征。
　　 3.mPEG-PLGA-PLL/siRNA和mPEG-PLGA-PLL-cRGD/siRNA纳米粒的体外释放低温超速离心法测定siRNAs的包封率，透析法测试siRNAs的体外释放。
　　 4.正交试验设计优化递送siRNAs的实验参数在单因素考察的基础上，选择载基因纳米粒、包裹微泡、超声辐照时间、超声功率、超声工作周期五个因素，利用L16(45)正交试验设计，筛选超声和微泡介导的非RGD载基因纳米粒mPEG-PLGA-PLL/siRNA和RGD载基因纳米粒mPEG-PLGA-PLL-cRGD/siRNA的优化参数。
　　 4.1 评价方法用倒置荧光显微镜定性观察、激光共聚焦显微镜定位观察、流式细胞仪定量检测PC-3细胞对分子探针Cy3标记的siRNA的细胞内摄取。
　　 4.2 统计学分析极差分析法评价L16(45)正交试验设计结果，配对t检验分析流式细胞仪的定量检测结果，单因素方差分析各实验组的细胞活性。P<0.05为统计学差异有显著性意义。4.3优化的实验参数重复验证实验利用筛选出的优化参数，进行前列腺癌PC-3的细胞内递送siRNA的体外对照实验研究。实验分成优化参数组、RGD载基因纳米粒组、非RGD载基因纳米粒组、空白对照组。
　　 结果：
　　 1.载基因纳米粒表征原子力显微镜观察测量，制备的非RGD载基因纳米粒mPEG-PLGA-PLL/siRNA和RGD载基因纳米粒mPEG-PLGA-PLL-cRGD/siRNA的粒径大小分别为(106.3±3.9) nm和(112.0±4.2)rnm；纳米粒的形貌呈圆形或类圆形，表面光滑，分布均匀，无凝集或粘连现象。电位/超细微粒粒度分析仪检测，制备的RGD载基因纳米粒的Zeta电位为-0.13mV。
　　 2.mPEG-PLGA-PLL/siRNA和mPEG-PLGA-PLL-cRGD/siRNA纳米粒体外释放规律mPEG-PLGA-PLL-cRGD/siRNA包封率为(72.38±1.70)％。24小时mPEG-PLGA-PLL/siRNA和mPEG-PLGA-PLL-cRGD/siRNA的siRNA释放率为50%，120小时累积释放量70%。
　　 3.递送siRNA的优化参数L16(45)参数优化实验中，筛选出的优化参数为：载基因纳米粒30μ1、超声微泡40μl，超声照射时间20秒、超声功率1.2瓦、超声工作周期20%。超声和微泡使非RGD载基因纳米粒mPEG-PLGA-PLL/siRNA和RGD载基因纳米粒mPEG-PLGA-PLL-cRGD/siRNA的实验剂量从40μl减少到30μ1，剂量降低率25%。
　　 4.优化参数的重复验证实验优化参数组和RGD载基因纳米粒组对照实验中，优化参数组的细胞摄取率和细胞荧光强度分别为(88.33±1.24)%和30.59，RGD载基因纳米粒组的细胞摄取率和细胞荧光强度分别为(93.49±1.37)%和34.28，p>O.05，两组统计学差异无显著性意义。优化参数组和非RGD载基因纳米粒组的对照实验中，优化参数组的细胞摄取率和细胞荧光强度分别为(84.78±2.13)%和27.18±0.91，非RGD载基因纳米粒组的细胞摄取率和细胞荧光强度分别为和(71.24±2.80)%和18.39±0.90，P　　 结论：
　　 1.超声和微泡与非RGD载基因纳米粒mPEG-PLGA-PLL/siRNA和RGD载基因纳米粒mPEG-PLGA-PLL-cRGD/siRNA联合应用，可以降低纳米粒的实验剂量，剂量降低率25%。
　　 2.超声和微泡能够提高非RGD载基因纳米粒mPEG-PLGA-PLL/siRNA的细胞摄取率和荧光强度，但是不能够提高RGD载基因纳米粒mPEG-PLGA-PLL-cRGD/siRNA的细胞摄取率和荧光强度。可能的机理是在超声和微泡存在的情况下，所产生的微冲流、切应力和微混合等二级非线性效应（现象）将靶向聚集在PC-3细胞表面的RGD纳米粒冲散或远离细胞上产生的微孔。