乳制品中荧光假单胞菌双重PCR检测方法的建立及嗜冷假单胞菌腐败潜力评价

摘要

荧光假单胞菌是乳制品中常见的污染菌，能够分泌耐热的胞外蛋白酶和脂肪酶。这些酶经过高温灭菌仍具有活性，能够分解乳制品中的蛋白和脂肪，使乳制品发生腐败、变质等质量缺陷。传统的标准平板培养检测方法时间长，重复率低，不能满足快速高通量检测乳品的要求，无法应用于大批量产品的实际检测中。鉴于此，我们希望能够建立起一种高效快速的检测方法。 聚合酶链式反应（PCR）技术自问世以来，因其高效特异且实验过程简便快捷等优点而备受人们青睐[1]。而目前 PCR检测食品中荧光假单胞菌的方法依然处于探索阶段，已有文献报道的检测靶点少，且缺乏系统评价。本实验在前人探索的基础上，利用已有报道的三株荧光假单胞菌的序列信息，选择高度保守的gyrB基因以及特异的 apr基因为标记基因，设计了10对单重引物，并筛选了两对引物（gyrB384和apr194），在此基础了建立了荧光假单胞菌双重PCR方法。经过反复实验最终确立了引物浓度配比（gyrB0.64μmol/L，apr0.4μmol/L），在该比例下，引物之间的互相干扰最小，产物条带（384 bp和194 bp）能够通过电泳实验直接用肉眼区分开；经过退火温度优化实验，最终确立60℃的退火温度，使得 PCR产物特异性最佳，且能达到最低检测灵敏度（16.9 fg/μL）；人工污染实验表明本研究设计的两对引物能够克服样品基质的干扰，而实际样品检测实验表明双重 PCR实验能够应用于实际检测中。本研究建立的双重PCR检测体系特异性高，灵敏度强，能够克服单重PCR“假阳性”的缺点，值得在实际检测中推广使用。 假单胞菌胞外蛋白酶能将牛乳中的酪蛋白水解，使牛乳沉淀、变苦，从而影响奶酪的发酵产量。传统的脱脂乳平板法只能定性检测假单菌胞外蛋白酶水解活力，本研究以偶氮酪蛋白为底物，对从上海地区牧场中随机挑选出的29株嗜冷假单胞菌的胞外蛋白酶水解能力和耐热性进行了定量检测，并评估了不同种假单胞菌的腐败潜力。基于rpoB基因对这29株假单胞菌在菌种层次进行种类鉴定，结果表明有14株菌属于荧光假单胞菌。分别在6℃和30℃两种培养条件下，对所有假单胞菌的蛋白酶水解活力进行定量检测，结果表明6℃下假单胞菌平均蛋白酶水解活力大小为3.46 DAh-1mL-1，30℃下假单胞菌平均蛋白酶水解活力大小为4.57 DAh-1ml-1。结果还表明荧光假单胞菌的蛋白酶酶活高于其它菌株，且这些菌株胞外蛋白酶有很好的耐热性，这表明荧光假单胞菌比其他假单胞菌具有更大的腐败潜力，也表明荧光假单胞菌双重PCR检测方法建立的必要性。 综上所述，本研究设计的双重PCR体系能够弥补常规PCR技术的不足，高效特异的检测出乳制品中的荧光假单胞菌，可应用于实际检测中，具备良好的应用价值。

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第一章 引 言

1.1 荧光假单胞菌概述

1.2 荧光假单胞菌的特征

1.3 荧光假单胞菌的流行病学特征

1.4 荧光假单胞菌对食品的危害

1.5 检测方法概述

1.6 荧光假单胞菌检测中存在的问题和展望

第二章 单重PCR检测靶点的筛选

2.1 材料与方法

2.2 实验结果

2.3 结果讨论

第三章 双重PCR检测体系的建立及评价

3.1 材料与方法

3.2 实验结果与分析

3.3 讨论

第四章 假单胞菌蛋白酶水解活力及耐热性研究

4.1 基于rpoB基因测序对假单胞菌种类进行鉴定

4.2假单胞菌金属蛋白酶酶活及耐热性测定

4.3 结果与讨论

第五章 总结及展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文及专利