对虾白斑综合征病毒(WSSV)三个基因的变异、克隆表达及其在WSSV感染中的作用

摘要

对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus, WSSV)是对虾养殖业中存在的主要病原之一，其感染机制尚未明了。本文通过2015-2016年我国部分对虾养殖区采集到的WSSV病虾，以ws v001、ws v025、ws v045三个基因为研究对象对WSSV变异进行分析，并进一步研究了它们在WSSV侵染过程中的作用。主要包括以下内容：
　　第一章：为了解我国主要对虾养殖区ws v001、ws v025、ws v045基因缺失变异情况，本研究取用2015-2016年从山东、河北、浙江、天津、海南和广东等六省市采集到的104份WSSV阳性样本，通过特异引物对目的片段进行扩增，借助测序对样本的缺失变异进行分析。结果显示，ws v001的检出率为25％，ws v025检出率为23.08%，ws v045检出率为45.19%， ws v025、ws v045的检出样品中，未发现缺失突变情况；氨基酸序列比对结果显示扩增的ws v001片段所编码氨基酸出现三类变异，包括第一类18个氨基酸小片段缺失，第二类121个氨基酸大片段缺失，第三类氨基酸插入情况，此外还有8个氨基酸存在突变。结果表明，我国不同地区wsv001基因及其编码氨基酸，存在明显的缺失变异。
　　第二章：对wsv001、wsv025、wsv045基因进行PCR扩增，成功得到目的片段并分别进行克隆，构建重组表达质粒pBAD/gⅢA-001、pBAD/gⅢA-025、pBAD/gⅢA-045，通过测序和双酶切验证克隆成功。诱导剂选择 L-阿拉伯糖，利用SDS-PAGE以及western-blot对表达产物进行检测分析，结果wsv025、wsv045蛋白成功表达，但表达量低；wsv001蛋白未得到表达。
　　第三章：利用RNA干扰技术，对wsv001、wsv025、wsv045实施基因沉默操作，对凡纳滨对虾进行WSSV人工感染后，检测其 ws v001、ws v025、ws v045基因的相对表达量，计算累积死亡率以及测定不同时间点病毒粒子的数目。结果显示，在干扰48-84 h, wsv001、wsv025、wsv045 mRNA水平上的相对表达量显著低于对照组，干扰ws v001、ws v025表达后，凡钠滨对虾的的死亡减缓；干扰ws v045表达后，有效的降低了虾的累积死亡率，这与病毒粒子数目的检测结果相一致。在检测48h和84h的dsRNA组中(wsv001、wsv025、wsv045)病毒粒子数目低于GFP组。RNAi实验结果表明wsv001、wsv025、wsv045参与WSSV的感染过程。

目录

声明

引言

第一章 对虾白斑综合征病毒概述与研究进展

1 WSSV病原学

2 WSSV流行病学

3 WSSV防治措施及RNA干扰技术的应用

4 本研究的意义及目的

第二章 中国部分地区对虾白斑综合征wsv001、wsv025、wsv045基因缺失变异情况

1 实验材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 wsv001、wsv025、wsv045基因克隆及原核表达

1 wsv001、wsv025、wsv045基因克隆

2 wsv001、wsv025、wsv045重组表达载体的构建及蛋白表达

3 讨论

第四章 运用RNA干扰技术研究wsv01、wsv025、wsv045基因在WSSV感染过程中的作用

1 实验材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

小结

参考文献

附录

致谢