一种高效促进血小板生成的全新型融合蛋白SCF-TPO的分子设计及其生物学活性研究

摘要

一种高效促进血小板生成的全新型融合蛋白SCF-TPO的分子设计及其生物学活性研究博士后刘楠导师奚永志教授中文摘要血小板减少症不仅是恶性血液病(如白血病、淋巴瘤及多发性骨髓瘤等)诱导缓解、巩固和加强化疗阶段的主要并发症，也是实体瘤及其它影响造血细胞疾病患者放化疗过程常见的严重并发症。血小板减少症的出现不仅增加了患者出血、感染引起的相关死亡风险，也由此限制了使用细胞毒性化疗药物的最大杀伤剂量。对肺癌、乳腺癌及卵巢癌等实体瘤有特效的新化疗药gemcitabine治疗过程中出现的血小板减少症限制了该药物的临床有效应用。同时，血小板减少症也是骨髓增生异常综合征(MDS)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、爱滋病(AIDS)及慢性肝病等疾病治疗过程中常见并发症，这类疾病出现的慢性血小板减少症起因为血小板生成缺陷或减少、免疫或非免疫性血小板破坏增强，另外进行肝移植、心血管手术等患者也常伴发血小板减少症，最终引起患者死亡率增加。有关血小板减少症的治疗始终是世界性医学难题。 目前临床上治疗严重血小板减少症的唯一方法是血小板输注。尽管输注血小板可以暂时缓解化放疗所致血小板减少引起的严重出血等并发症，但多次反复输注血小板增加了疾病传播机会、发热、同源免疫反应及移植物抗宿主病等不良反应，也增加了患者住院费用及输注带来的不适感。而且，社会上有限的供血来源也制约着血小板输注。再者，临床上为达到较为彻底地杀灭残留白血病或其它肿瘤细胞而越来越多使用的多药物、高剂量联合化疗方案和造血干细胞移植以及强支持治疗也增加了对血小板成分输血的需求。因此，为缓解血小板输注的供需矛盾并降低血小板输注的治疗费用，以及减少血小板输注引起的不必要的诸多不利因素，努力寻找一种有效促进血小板生成剂，从而彻底改变临床上化放疗引起的严重血小板减少症，已显得十分迫切和必要。TPO和SCF的克隆成功为解决这一医学难题带来了希望。 细胞因子是由造血系统产生的一种高活性的蛋白质或多肽，通过与其细胞表面相应的受体结合，调节相应靶细胞的增殖、分化及其靶细胞介导的生物学效应过程从而参与机体造血调控、免疫应答等生理及病理过程。利用细胞因子的这一特性，凭借基因工程技术和蛋白质工程技术将两种细胞因子构建成融合细胞因子，使之即具有单个细胞因子的生物活性，也可通过生物活性的互补及协调效应发挥出较单一细胞因子更佳的生物学活性，而同时又可避免两种细胞因子单独发挥作用时因高剂量使用出现的毒副作用，从而为细胞因子的理论研究和临床应用提供新的方法。迄今为止，国内外学者经过不懈的努力构建了许多的细胞因子融合蛋白，比较成功细胞因子如MEN1103(GM-CSF/EPO)，PIX321(GM-CSF/IL-3)和IL-3/EPO已进入了Ⅰ/Ⅱ期临床实验，表现出较好的生物学功能和良好的临床应用前景。可以断言，细胞因子融合蛋白是当今免疫学研究领域的一个热门问题。 人类TPO基因定位于3号染色体长臂2区6带或7带(3q26，27)，含5个编码的外显子，编码产物为335个氨基酸，包括前面21个氨基酸的信号肽序列，分子量为70KD。TPO结构包括两个特征性结构：氨基端受体结合区和羧基端TPO糖基化区，其中154氨基酸长度的氨基端与人EPO氨基端有23％的序列同源性，与IFN较少同源，该区是TPO的功能区，主要起结合受体、信号传导和支持细胞增殖作用；羧基端区(153-332)约占70KDTPO的一半，与其他已知的蛋白无同源性，但富含丝，苏和脯氨酸，主要增强TPO的稳定性。TPO在Cys7-Cys151和Cys29-Cys85有两个与其生物学功能有密切关系的二硫键。TPO是巨核细胞成熟的主要调节子，能诱导巨核系祖细胞的增殖；TPO也能支持造血干细胞的存活，与IL-3，SCF和GM-CSF协同诱导造血干细胞进入细胞循环并增加原始和分化造血祖细胞数量。干细胞因子(SCF)，又称c-kit配体，是一个作用于较原始和成熟祖细胞的造血生长因子，其基因定位于12号染色体，含有8个外显子，基因长50kb。由于外显子6处的剪切，SCF可有两种形式：SCF248和SCF220(膜结合型)。SCF248在Ala165位有一个特殊的蛋白裂解位点，产生由胞外区165氨基酸组成的可溶型SCF；SCF220缺乏此裂解位点，由157氨基酸胞外区，27氨基酸跨膜区和36氨基酸胞浆区组成。两种形式的SCF都具有生物学活性，都能促进祖细胞的存活，与其它造血细胞因子如GM-CSF，EPO，G-CSF和IL-3协同作用支持多系克隆BFU-E，CFU-GM和CFU-GEMM等的生长。SCF在体内外扩增干细胞、干细胞动员、再生障碍贫血等方面有广泛的临床应用价值。 本研究通过基因工程方法设计并构建了携带SCF/TPO融合基因的原核表达载体，收集并纯化该融合蛋白。在体外实验中证实了该融合蛋白有较好的造血促进作用。 首先，根据已发表的资料设计两对引物，以从胎肝细胞中提取总RNA为模板进行RT-PCR，扩增所需的SCF和TPO氨基端功能区片段。采用融合基因策略，将SCF和TPO基因融合并连接于原核表达载体PET32a的salI-NotI位点中，通过0.5MIPTG诱导引发下游的SCF-TPO融合基因的高表达。融合基因主要以包涵体形式表达，表达量高达全菌蛋白的30％以上。分别采用抗SCF和抗TPO的多克隆抗体对上述表达产物进行Westernblot鉴定，发现在60KD处分别有明显的阳性条带，表明我们已成功地获得了SCF-TPO融合蛋白。 随后，我们建立了高效快捷行之有效的分离大量重组SCF-PO融合蛋白的下游纯化路线，即金属螯合层析法。由于所选用的原核表达载体pET32a在表达目的蛋白N端带有6个组氨酸，这将十分有利于通过Ni-NTA金属螯合层析法快速高效地纯化表达产物。由此方法纯化的SCF-PO融合蛋白的纯度可达90％以上，而且总回收率高。 最后我们开展了对SCF-PO融合蛋白体外生物学功能的研究。采用分析软件，对我们设计的SCF-PO融合蛋白的柔性、抗原性、亲水性和二级结构等分子生物学特性进行了计算机模拟预测。证明该融合蛋白保留了SCF和TPO原有氨基端的生物学特性，所设计的接头具有高柔性、低抗原性和低表位性。选用对人GM-CSF依赖的MO-7e细胞株鉴定了纯化复性后SCF-TPO融合蛋白对MO-7e细胞株的促增殖作用。MTT法检测的结果表明SCF-TPO融合蛋白能明显刺激MO-7e细胞的增殖。该融合蛋白在一定培养条件下对小鼠骨髓CFU-MK集落细胞具有维持生长作用，这种作用可以持续3周。 综上所述，通过本研究我们成功地构建了SCF-TPO融合基因的高效原核表达体系，通过纯化得到了纯度高达90％的目的蛋白，应用两步透析法获得了复性良好的SCF-TPO融合蛋白，在体外实验中初步证实SCF-TPO融合蛋白同时具有SCF和TPO的生物活性，与标准品相似。SCF-TPO融合蛋白能够促进造血细胞增殖，为进一步进行，制备人SCF-TPO融合蛋白以便深入研究该SCF-TPO融合蛋白的体内造血活性奠定了基础。

目录

论文说明：英文缩写词表

前言

第一部分重组SCF-TPO融合基因的克隆及表达

一材料与方法

二结果

三讨论

参考文献

第二部分重组SCF-TPO融合基因表达产物的纯化

一材料与方法

二结果

三讨论

参考文献

第三部分重组SCF-TPO融合蛋白分子生物学预测及初步活性鉴定

一材料与方法

二结果

三讨论

参考文献

结论

致谢

文献综述 TPO和SCF的临床应用进展