基于等温杂交链式反应的无标记化学发光DNA检测新技术

摘要

据现代医学和生命科学的研究成果，许多疾病如癌症和遗传病的发生和发展都与基因的突变有关，另外许多传染性疾病是由环境中的病毒所引起的，因此对特定序列DNA的分析以及对DNA链中碱基突变的检测在基因筛选、法医学鉴定、遗传疾病的早期诊断和治疗、病原基因的测定方面具有十分深远的理论意义和应用价值。近年来，快速可靠的特定序列DNA检测技术得以迅速发展，按照有无标记物可分为标记和无标记两类。标记的DNA检测技术灵敏度高，但在一定程度上检测过程更为复杂，且检测成本较高。相对而言，无标记的DNA检测技术一般较为简单快速，成本相对较低，已将其广泛应用于分子生物学、法医学、临床诊断学等领域。
　　化学发光(CL)分析是根据化学反应产生的光辐射确定物质含量的一种痕量分析方法。CL分析具有灵敏度高、线性范围宽（3-6个数量级）、分析速度快以及仪器设备相对简单、便宜等优点，已成为现代痕量分析中一个十分活跃的研究和应用领域。2003年课题组首次报道了基于鸟嘌呤特异性CL的无标记(磁性微球表面瞬时衍生)DNA检测新技术，发表在《Chemical Communications》(2003，2888-2889)。它是将无鸟嘌呤的DNA探针固定于磁性微球，杂交端粒序列后，利用特异性CL反应试剂——3，4，5-三甲氧基苯甲酰甲醛(TMPG)与目标序列中鸟嘌呤产生瞬时的CL，进行端粒检测。2008年，课题组偶合PCR技术，发展了依据不同载体物理性质差异识别、无标记型多组分CL检测新技术，成功应用于3种乙肝病毒DNA的检测，发表在2008年的《Analytical Chemistry》(2008，1606-1613)。2011年，课题组通过将成百上千条的适配体序列自组装于聚苯乙烯微球表面，实现了蛋白质IgE的高灵敏度、无标记CL检测。
　　核酸扩增技术是指在分子生物学中对特定的DNA序列进行体外扩增的一种技术，如传统的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)以及近年来发展起来的等温扩增技术如滚环扩增反应(Rolling Circle Amplification，RCA)和杂交链式反应(Hybridization Chain Reaction，HCR)，已广泛应用在特定DNA序列、蛋白质和小分子等物质的高灵敏检测中。
　　在课题组目前研究工作的基础上，本论文将CL分析和等温杂交链式扩增技术相结合，发展了两种具有创新意义的高灵敏度无标记DNA的CL检测技术，全文由以下三部分构成:
　　第一章:DNA检测意义与研究进展
　　第一节主要介绍课题背景及研究意义:包括特定序列DNA检测的意义、新型核酸等温扩增技术和无标记DNA检测的新进展。第二节主要介绍了CL分析技术的基本原理及特点，并介绍CL分析技术在DNA分析领域的应用。第三节主要阐述了本论文的研究目的、意义，并概括论文的主要研究内容及创新之处。
　　第二章:偶合杂交链式反应的无标记化学发光DNA检测新技术
　　本章偶合HCR放大反应，建立了特定序列DNA的无标记CL检测新技术。CL信号由特异性化学发光试剂3，4，5-三甲氧基苯甲酰甲醛(TMPG)与DNA序列中G碱基发生瞬时衍生反应产生，无需标记。实验中首先验证了无标记检测技术的可行性，随后详细考察了HCR放大效果，并优化了各项实验参数，如磁性微球的用量，捕获探针的用量和HCR反应条件等。研究发现，在1 fmol-5 pmol(10 pM-50 nM)的浓度范围内，CL强度与目标DNA浓度呈线性相关(LogI=0.751LogC+2.001，R2=0.993)，最低可检测浓度为1 pM。该技术采用磁性微球作为富集载体，具有操作简单、快速、灵敏度高的特点。
　　第三章:聚苯乙烯微球-杂交链式反应双重放大的无标记化学发光DNA检测新技术
　　在第二章工作的基础上，本章进一步构建了一种基于聚苯乙烯微球-HCR双重放大的特定序列DNA的检测新技术。首先将捕获探针通过羧基-氨基反应固定在磁性微球上表面，报告探针和HCR引发探针通过链霉亲和素-生物素反应自组装在聚苯乙烯微球表面形成放大复合物;目标DNA加入后，将聚苯乙烯微球放大复合物杂交在磁性微球表面。由于每个聚苯乙烯微球表面结合有大量含有G碱基报告探针和HCR引发探针，构成一级放大;随后加入两种HCR单体，进行HCR扩增反应，得以在磁性微球表面第二次引入大量的G碱基，构成第二级放大，然后磁性分离，TMPG检测。结果表明:该方法具有操作简单、稳定可靠、快速灵敏，检测时间短的特点，在0.01 fmol-10 pmol(0.1 pM-100 nM)浓度范围内具有良好的线性关系(R2=0.991)，最低可检测浓度为5amol(50 fM)，与第二章第一节直接检测方法相比，该法灵敏度提高2×104倍;与第二章第二节采用HCR反应作为放大技术相比，灵敏度提高了20倍。错配识别能力强。综上所述，本章构建的新技术非常适合于高灵敏度特定序列DNA的检测。

目录

声明

论文说明

摘要

第一章 DNA检测意义与研究进展

第一节 课题背景及意义

1．1 DNA检测基本原理

1．2 核酸等温扩增技术

1．3 无标记DNA检测技术的研究进展

第二节 化学发光DNA检测技术的研究进展

2．1 CL基本原理

2．2 标记CL检测技术

2．3 无标记的CL检测技术

第三节 论文研究内容及创新点

参考文献

第二章 偶合杂交链式反应的无标记化学发光DNA检测新技术

第一节 无标记化学发光检测特定DNA序列的研究

1．1 引言

1．2 实验部分

1．3 实验方法

1．4 结果与讨论

1．5 总结

第二节 基于链式杂交反应的无标记化学发光DNA检测新技术

2．1 引言

2．2 实验部分

2．3 实验方法

2．4 结果与讨论

2．5 总结

参考文献

第三章 聚苯乙烯微球-杂交链式反应双重放大的无标记化学发光DNA检测新技术

3．1 引言

3．2 实验部分

3．3 实验方法

3．4 结果与讨论

3．5 总结

参考文献

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致谢