人脐带间充质干细胞干预衰老相关认知功能下降的作用及机制研究

摘要

衰老是一种多因素、多器官参与的综合性现象。当个体成熟并随着年龄增长，机体在形态结构、生理功能等方面会出现一系列的退行性变化，而脑是受衰老影响最大的器官之一[1,2]。
　　脑衰老分为生理性变化与病理性变化，前者引起的认知能力减退的现象被定义为衰老性认知(Cognitive aging)[3,4]，其并不被认为是疾病状态，后者与阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)等神经退行性疾病的发生有关。脑衰老在早期表现为与年龄和教育程度相对的学习记忆能力或者其它脑功能的减退，并且逐渐发展为学习记忆能力下降、执行功能障碍和行为改变等全面性痴呆[5]。
　　生理性脑衰老没有发生大量神经元凋亡的现象[3,6]，主要表现树突棘密度的降低，突触数量的减少，突触后膜致密物PSD(Post-synaptic density)的变薄，突触可塑性以及神经发生能力的下降，这些被当作是衰老时学习记忆等认知能力下降的重要原因[7-11]。阿尔茨海默病(AD)是一种进行性神经退行性疾病，以进行性记忆力减退和获得性知识丧失、直至完全丧失日常生活活动能力为特征；其两大病理特征是Aβ沉积形成老年斑(Senile plaque,SP)和Tau蛋白缠结形成神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles, NFTs)，另外还有神经退行性疾病的共有特征，即大量神经元的凋亡[12]。
　　国际阿尔茨海默病协会(Alzheimer's Disease International,ADI)2016年公布的数据，随着人类寿命的延长，与衰老相关的认知功能障碍的发病率呈现上升趋势[13]。脑衰老伴随衰老性认知等多种改变，会引起老人生活质量的下降，带来巨大的家庭、社会负担；甚至进展为AD在内的多种神经退行性疾病，带来更为严重的后果，成为严重的社会和医疗卫生问题。目前，对衰老相关认知功能障碍的治疗以缓解相关症状的药物、认知训练、健康的生活方式和饮食疗法为主[14]，但干预治疗效果均十分有限。
　　脑的衰老会引起大脑内微环境的改变，进而抑制神经发生能力，破坏神经网络原有平衡，引起记忆力下降等一系列功能改变[15,16]。近期的研究表明，通过年轻血液的循环灌注可有效改善年老实验动物骨骼肌、肝脏、脊髓和脑等多种组织器官内干细胞[17,18]的功能状态，推测年轻个体来源的血液可能通过某些“年轻”活性因子发挥作用，通过系统性调节，从而延缓和逆转年老个体的衰老相关病变。尽管这种说法仍有待进一步考证，但这提示我们，可以利用某些“年轻”因子的干预，通过系统性调节衰老个体的神经系统，同时激活内源性神经干细胞，有可能成为有效改善和逆转脑衰老带来的认知性障碍的新策略。有研究表明，通过间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植可以有效的修复骨、心脏、肺脏等多种组织器官[19-21]。间充质干细胞发挥其治疗作用的方式包括分化替代和通过强大的分泌作用发挥免疫调节、改善微环境、促血管新生、抑制凋亡、营养支持等[22,23]。而在众多间充质干细胞中，人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)作为医疗废弃物，更加容易获取、无论理学争议，更重要的是其免疫原性更低、处于更早的生命周期、易分离纯化[24]，这些使它成为临床细胞治疗更理想的种子细胞[25]。
　　在此基础上，我们提出假设：hUC-MSCs作为“年轻”干细胞，在特定条件下能够分泌大量具有多重功能的细胞调节因子等活性物质，通过系统性调节，可能对改善衰老大脑的生理或病例状态具有重要的作用。
　　为了验证我们提出的假说，将分为两个部分开展相关作用和机制的探索—hUC-MSCs干预衰老性认知的作用及其机制，以及 hUC-MSCs治疗阿尔茨海默病的作用及其机制。我们分别选用D-半乳糖(D-galactose)致衰老小鼠作为研究衰老性认知的模型，SAMP8小鼠(Senescence-accelerated mouse/prone8)作为研究阿尔茨海默病的模型。
　　研究表明，小鼠等啮齿类动物长期皮下注射高剂量 D-半乳糖，会引起机体代谢紊乱，进而加速其脏器尤其是脑的退行性变化，类似于自然衰老的表现[26]，主要体现在细胞转录水平降低[27]和海马区神经再生障碍[28-30]等衰老改变。所以，在本研究中，我们选择D-半乳糖致衰老小鼠模型作为研究衰老性认知的动物模型。
　　另外，SAMP8小鼠显示了许多阿尔茨海默病所具有的特性，如行为紊乱、记忆力下降、β淀粉样蛋白沉积和tau蛋白磷酸化等，它以早期发生快速老化且伴随显著的学习记忆能力障碍为特征，且随增龄而加重[31-33]。SAMP8是自然筛选得到的疾病模型，它的发育和成长，更加符合自然状态下，从脑衰老进展为阿尔茨海默病的过程。因此，在本研究中，我们选择SAMP8小鼠作为研究阿尔茨海默病的动物模型。
　　由于MSCs直径大、粘附力强的原因，在小鼠等多个物种上静脉注射MSCs会引起不同程度肺不张和肺栓塞[34,35]。而有研究称，通过腹腔注射间充质干细胞可以改善小鼠肌肉状态、延长小鼠寿命[36]和改善小鼠脑白质营养不良[37]。这为我们选择腹腔移植的方式，来研究 hUC-MSCs是否可以通过分泌途径改善衰老模型鼠和AD模型鼠的认知能力提供了依据。
　　我们知道，在人类和小鼠的衰老过程中，大脑海马极易受损，主要表现为神经发生能力下降、突触可塑性相关基因下调表达、新生神经元减少、树突棘密度降低，并带来相应的突触可塑性降低和认知功能下降[38,39]。所以，以上指标是我们评判 hUC-MSCs干预衰老相关认知功能障碍的主要指标。另外，海马区是调节情景记忆和空间记忆的主要脑区[40]，在认知功能的评价上我们采用了评价空间学习记忆能力和情景记忆的相关行为学实验：Morris水迷宫、Y迷宫、新物体识别、穿梭箱和条件恐惧实验等。
　　首先，在衰老性认知模型鼠的实验中，我们发现在建模后，模型鼠发生了一系列的脑衰老特征的改变：空间学习记忆功能的下降；CA1（Cornu ammonis1,安蒙氏角1）突触可塑性下降，CA1区锥体神经元的树突棘密度明显降低；超微结构显示，在海马CA1和DG（Dentate gyrus，齿状回），兴奋性突触的突触后膜致密物变薄，神经元的微丝微管排列紊乱，髓鞘水肿分解，线粒体结构破坏；海马体内，兴奋性突触后膜致密物的主要成分PSD-95表达下降。hUC-MSCs移植后，上述脑衰老的特征得到了明显的改善。同时，hUC-MSCs能够通过激活模型鼠大脑中内源性神经干/祖细胞，从而促进了大脑的神经发生。进一步研究发现，移植的hUC-MSCs能够通过激活模型鼠大脑海马内ERK-CREB途径，从而发挥其干预作用。
　　其次，在AD模型鼠实验中，hUC-MSCs改善了包括对环境适应能力、探索活力、条件记忆能力、对已知事物的记忆识别能力和空间定位的能力在内的认知能力。并且，hUC-MSCs治疗小鼠的海马和皮层内，包括P-tau（S396）、GSK-3β、BACE1、APP在内的AD相关蛋白的表达量得到下调，且其皮层和海马内神经干细胞标志 Nestin表达量上调。进一步，通过高通量筛选、生物信息学分析和多个AD细胞模型，筛选出关键的作用因子HGF，并且在AD模型鼠上确认了HGF的治疗作用。通过体外模型证实，hUC-MSCs能够通过HGF/c-Met系统介导，激活AKT通路，进一步抑制GSK-3β的活性，从而下调Tau蛋白的磷酸化水平，最终修复受损的神经细胞。
　　综上，两部分结果表明，一方面 hUC-MSCs能够通过分泌途径在生理性脑衰老方面进行系统性的干预和改善衰老小鼠脑衰老性特征；另一方面，针对病理性脑衰老的典型疾病状态阿尔茨海默病，hUC-MSCs能够明显改善AD模型鼠的病理特征，并且增强其突触可塑性、提高其认知功能，其分泌因子HGF发挥了关键的调节作用。我们的研究为hUC-MSCs改善和逆转脑衰老引起的认知能力下降提供了新的理论依据和干预新策略。

目录

声明

缩略词表 (Abbreviations)

第一部分 hUC-MSCs对衰老小鼠认知功能的改善作用及其机制

前言

第一节 hUC-MSCs的分离培养和鉴定

材料与方法

实验结果

小结

第二节 hUC-MSCs明显改善衰老小鼠的认知功能

材料与方法

实验结果

小结

第三节 hUC-MSCs促进衰老小鼠大脑中内源性NSCs的增殖和向神经元分化

材料和方法

实验结果

小结

第四节 hUC-MSCs通过ERK-CREB途径提高衰老小鼠的认知功能

材料与方法

实验结果

小结

讨论

第二部分 hUC-MSCs对阿尔茨海默病小鼠模型的治疗作用及其机制

前言

第一节 hUC-MSCs对SAMP8模型小鼠的治疗作用

材料与方法

实验结果

小结

第二节 hUC-MSCs培养上清和HGF对AD细胞模型中损伤神经元的修复作用

材料和方法

实验结果

小结

第三节 HGF对SAMP8模型小鼠的治疗作用

材料与方法

实验结果

小结

第四节 HGF通过c-Met-AKT-GSK-3β通路下调P-tau的表达

材料和方法

实验结果

小结

讨论

参考文献

附录 主要仪器

代表性论著

个人简历

致谢