羧基裂解酶基因在施氏假单胞菌N2代谢苯酚过程中的作用研究

摘要

苯酚是普遍存在于环境中常见的污染物，目前已分离出诸多能以苯酚为唯一碳源和能源的菌株。对细菌中苯酚羟化酶、邻苯二酚邻/间位开环裂解酶研究较为充分。而苯酚羧化是启动苯酚代谢的主要途径之一，目前仅有厌氧条件下羧化的报道。本课题组前期分离获得一株快速降解苯酚的菌株—施氏假单胞菌N2，在好氧代谢时常产羧化中间产物。本文旨在调取其羧基裂解酶基因，构建基因工程菌，研究并揭示相关基因在降解苯酚过程中的作用。 本论文以野生施氏假单胞菌N2为研究对象，利用分子生物学技术构建羧基裂解酶基因突变株，以液相色谱、气相色谱-质谱联用仪及其紫外光谱等分析技术，研究野生菌株及其突变株代谢苯酚的差异性，揭示了ubiX和ubiD基因在施氏假单胞菌N2降解苯酚过程中的作用，获得以下成果： （1）发现施氏假单胞菌N2中ubiD和ubiX两个基因目前功能并不明确。利用分子生物学技术成功构建施氏假单胞菌 N2两株羧基裂解酶基因单突变株N2ubiD-、N2ubiX-和双突变株N2ubiX-ubiD-等基因工程菌。 （2）研究发现缺失ubiD和ubiX基因降低菌株抵抗苯酚毒性和降解苯酚的能力，尤其是缺失ubiX基因使菌株前期代谢苯酚的能力明显下降。缺失基因ubiD则不易以间位开环裂解方式降解苯酚，而缺失基因ubiX则不易以邻位开环裂解。尽管野生菌和突变菌以苯酚为唯一碳源生长时，均能通过羟化和羧化启动苯酚的代谢，并产“顺，顺-己二烯二酸”和“2-羟基粘糠酸半醛（2-HMS）”开环裂解中间物，但仅野生菌株与单突变株N2ubiX-代谢苯酚时，易检测到羧化+还原反应转化的开环裂解产物，说明ubiD易在细胞中产生还原能力。 （3）共存乙醇和丙酮等碳源能提高双突变菌株N2ubiX-ubiD-抗苯酚毒性及代谢苯酚的能力，使其在后期，生长速度加快。而共存乙醇能加快N2菌野生株及其突变株对苯酚的降解与转化。共存乙醇均能同时诱导各菌株中“邻苯二酚1，2-双加氧酶”和“邻苯二酚2，3-双加氧酶”。而缺失ubiX基因的突变株，因乙醇共存可明显减少降解液中顺，顺-己二烯二酸和2-HMS的积累量，说明这两个中间产物被该菌株进一步降解转化速度较快。