胰岛素血糖依赖性和非依赖性心肌保护作用及抗肾上腺素能心肌保护新机制

摘要

研究背景:
　　“葡萄糖-钾-胰岛素”（GIK）极化液作为辅助治疗措施用于急性心肌缺血（AMI）的治疗已有近半个世纪的历史，基于动物及体外实验的基础研究均多次证实GIK及其关键成分胰岛素在保护缺血心肌方面的有益作用。然而，GIK应用于AMI治疗的临床试验结果不一，围绕GIK临床有效性及其作用机制的诸多争议性问题，至今在基础和临床研究领域尚未有确凿的实验依据给予明确回答。例如，有学者撰文分析GIK临床试验阴性结果的可能原因是GIK使用过程中血糖控制不当，但这一观点尚未得到实验确证，胰岛素降糖作用（即血糖依赖性作用）在胰岛素心肌保护效应中充当着怎样的角色，有待进一步探讨，且对于这一问题的研究在GIK/胰岛素的临床应用具有重要价值。
　　我们在前期的研究工作中发现，胰岛素除代谢调节作用外，可以直接激活心血管内源性Akt-eNOS系统，激活细胞“生存信号”保护缺血心脏。我们和国际上多个实验室也相继报道了胰岛素糖代谢作用以外的直接心血管保护效应，如抑制心肌细胞凋亡、保护血管内皮、抗炎、抗氧化应激、正性肌力作用等。然而，以往对于上述胰岛素非代谢性效应的观察往往同时与胰岛素降糖过程相伴随，胰岛素降糖以外的心肌保护作用与其代谢调节作用的相互关系及各自的作用尚不明确。
　　针对这一问题，最近危重症治疗研究领域根据临床和动物实验结果率先提出，危重症治疗中胰岛素带来的治疗收益完全取决于并得益于其降糖作用，而胰岛素降糖以外的作用甚微。然而遗憾的是，上述对于胰岛素应用于危重症的临床和实验观察并未评价心脏损伤和心血管终点事件。因此，胰岛素在AMI中的心肌保护作用是否应完全归功于其降糖作用，抑或存在血糖非依赖性的直接保护效应？阐明胰岛素对缺血心肌的保护效应与血糖的关系，并寻找血糖非依赖性心肌保护效应存在的直接证据和作用机制，将对胰岛素在AMI的临床应用提供重要的实验依据和指导价值。
　　实验目的:
　　利用接近于临床的大动物模型，探讨心肌缺血再灌注过程中，胰岛素血糖依赖性和非依赖性作用的相互关系及各自对胰岛素心肌保护效应的意义和相关机制。
　　实验方法
　　1.将犬随机分为4组：正常胰岛素、正常血糖组(NormalInsulin/Euglycemia,NI/NG组);正常胰岛素、高血糖组(NormalInsulin/Hyperglycemia,NI/HG组);高胰岛素、正常血糖组(HighInsulin/Euglycemia,HI/NG组）;高胰岛素、高血糖组(HighInsulin/Hyperglycemia,HI/HG组)。为阻断因血糖波动引起的内源性胰岛素释放，通过结扎犬胰周血管阻断胰岛素分泌入血。建立犬急性心肌缺血再灌注（MI/R）模型：利用电磁流量计和血管狭窄器制造50分钟的局部定量缺血，使左前降支（LAD）血流量降低80％，此后释放狭窄器恢复血流，再灌注4小时。于再灌注前5分钟微量泵静脉输注50％葡萄糖和GIK极化液用于对血糖和血浆胰岛素水平的干预。
　　2.实时测量血糖，血浆胰岛素、C肽水平、游离脂肪酸含量，以进行血糖和胰岛素水平控制和代谢评价。于缺血前、缺血后50min及再灌注4h分别同时从前室间隔静脉和左股动脉取血，立即进行血气分析，检测PO2、PCO2、pH、血红蛋白(Hb)及血样饱和度(SO2)，用于计算LAD灌注区心肌组织氧耗率和心肌呼吸指数。
　　3.通过多道生理记录和分析处理系统持续记录犬心电、冠脉LAD血流量和血流动力学指标。于再灌注结束后用伊文氏蓝/TTC双染色法测定心肌梗死面积。血浆肌钙蛋白T作为心肌损伤标志物，用于细胞坏死程度的评价。采用免疫组织化学方法分别检测Caspase-3活化及TUNEL凋亡指数用于定性和定量检测细胞凋亡。
　　4.采用石蜡包埋切片的苏木素-伊红染色方法，评价再灌注后心肌坏死周边区白细胞浸润程度，同时测量组织中髓过氧化物酶（MPO）含量以定量评估组织炎症反应水平。检测组织丙二醛(MDA)含量用于评估脂质过氧化水平，测量超氧化物歧化酶(SOD)以评价内源性抗氧化能力。
　　5.在数据采集和统计过程中采用严格排除标准以保证各实验组纳入的动物样本具有可比性。
　　实验结果:
　　1.本实验成功建立犬急性心肌缺血再灌注损伤模型。再灌注后心肌出现明显梗死区，细胞凋亡和坏死，及组织炎症反应和氧化损伤。
　　2.胰腺手术造成的胰腺缺血和局限性炎症在实验观察时程内对全身性炎症反应和心脏功能影响甚微。通过平行实验，在建立心肌缺血再灌注模型前分别实施胰周血管结扎手术和假手术以对比观察。两组间血清胰淀粉酶、胰脂肪酶、心肌肌钙蛋白T(cTnT)和肌酸激酶同工酶（CK-MB）的基础值和术后5小时测量值均无显著性差异，且血流动力学的同步观测显示心脏功能亦无明显变化。
　　3.高血糖存在情况下心肌I/R损伤程度进一步加重。表现为高血糖组较正常血糖组心肌收缩功能恢复障碍进一步加重，梗死面积扩大，细胞凋亡和坏死增多，炎症和氧化损伤加重（NI/HGvs.NI/NG,HI/HGvs.HI/NG,n=8,P<0.05）。
　　4.胰岛素干预可显著增加冠脉流量，提高代谢效率，增强心肌收缩功能，且这些有益作用不受血糖高低的影响。高胰岛素组较正常胰岛素组再灌注后收缩功能（心率压力指数、最大收缩速率）明显提高，LAD灌流区血流量增加，心肌组织葡糖糖摄取率明显升高，游离脂肪酸（FFA）摄取率轻微下降，心脏呼吸指数明显上升（HI/NGvs.NI/NG,HI/HGvs.NI/HG,n=8,P<0.05），提示胰岛素诱导心肌氧化代谢底物由FFA向葡萄糖转变。且在心功能明显改善的前提下，心肌氧耗并未显著增高，表明心肌氧利用率的提高。
　　5.当血糖钳夹在生理水平时，胰岛素水平升高可进一步缩小梗死面积，抑制细胞坏死和凋亡，降低炎症反应和氧化应激(HI/NGvs.NI/NG,n=8,P<0.05)。但此作用需以降糖为前提，高血糖存在时，上述保护作用消失(HI/HGvs.NI/HG,n=8,P>0.05)。
　　结论:
　　1.高血糖可显著加重心肌损伤并掩盖胰岛素保护作用，因而胰岛素降糖作用在其抗I/R损伤保护缺血心肌的效应中扮演着关键角色。
　　2.胰岛素具有独立于降糖效应、直接的心血管保护作用，其中包括不依赖于血糖控制水平的直接正性肌力作用、冠脉扩张作用及对心肌氧化代谢效率的促进作用。更为重要的是，胰岛素减轻心肌损伤，抑制细胞凋亡，降低组织炎症反应和氧化应激的有益作用，虽然依赖于正常血糖的维持，但独立于降糖作用而存在。
　　PartII胰岛素抗肾上腺素能心肌保护新机制的研究
　　研究背景:
　　急性心肌缺血发生时普遍存在着心脏交感-肾上腺素能系统的激活，一系列证据提示，交感-肾上腺素能活性增强及其介导的儿茶酚胺分泌释放是加重缺血心肌损伤、诱导致命性心律失常发生的重要原因之一，且与心脏重构、心力衰竭的发生发展密切相关。其中，儿茶酚胺对心脏的直接作用主要由β-肾上腺素受体(adrenergicreceptor,AR)所介导，因此β受体阻滞剂被广泛应用于临床AMI的治疗。
　　越来越多的证据表明，胰岛素除了在维持心肌代谢稳态中发挥重要作用外，还在多种生理、病理过程中发挥关键调控作用。通过前述实验一的研究，我们在大动物MI/R模型上首次证实了胰岛素独立于降糖作用之外直接的心肌保护作用。例如，我们在前期研究中发现，胰岛素可激活“PI3K-Akt-eNOS”细胞生存信号抑制心肌细胞凋亡，保护冠脉内皮，抑制炎性反应和氧化应激，促进再灌注后心脏功能的恢复。此外，我们和国际上多个实验室也发现了胰岛素的直接心脏正性变力作用，表现为在整体动物模型中增强心肌收缩功能，在细胞水平增强收缩幅度和钙瞬变。
　　心肌细胞膜上同时存在着大量的胰岛素受体和β受体。已有研究报道，在人脂肪细胞和平滑肌细胞中，胰岛素可直接对抗儿茶酚胺的脂解作用；相关分子水平的研究也支持胰岛素对β受体信号调控作用的存在。最近有细胞实验显示，心肌细胞中PI3K信号可抵消cAMP信号系统介导的Ca2+内流和正性变力作用。然而，在心肌细胞中，胰岛素对β受体激动效应可能的调控作用所知甚少，目前仅有的少数文献报道尚存争议。
　　儿茶酚胺的正性肌力作用主要通过β受体内传，经cAMP的生成激活蛋白激酶A(PKA)，进而磷酸化一系列下游分子，参与对兴奋-收缩偶联的调控。其中PKA的靶分子之一肌浆网受磷蛋白(PLB)的磷酸化水平可直接调控SERCA2a活性，而后者是与心肌细胞Ca2+释放、摄取、贮存有关的肌浆网内主要钙转运蛋白之一，也是推动心肌收缩舒张过程的关键蛋白酶。此外，MI/R伴发的一系列细胞内环境稳态的改变，如儿茶酚胺的大量释放，细胞内钙超载，氧化应激等，均可通过改变PLB磷酸化状态及SERCA2活性，加重MI/R心肌收缩功能的损伤。然而，MI/R时βAR激活加重心肌损伤，以及胰岛素对βAR系统的拮抗作用是否与肌浆网钙调控蛋白的功能调节有关，目前尚不明确。
　　实验目的:
　　本研究旨在探讨急性MI/R过程中，胰岛素是否对βAR系统具有调控作用；在回答第一个问题的基础上，我们将进一步围绕细胞内肌浆网钙调控蛋白的调节，寻求胰岛素调控βAR系统作用的分子机制。
　　实验方法:
　　1.采用Langendorff离体灌流系统制备大鼠离体心脏缺血再灌注模型。离体灌流心脏随机分为以下5组：⑴shamMI/R组；⑵MI/R组：30min局部缺血/2h再灌注；⑶MI/R+Ins组：再灌注前5min开始给予10-7mol/L胰岛素；⑷MI/R+ISO组：缺血前10min开始给予10-9mol/L异丙肾上腺素（ISO）；⑸MI/R+Ins+ISO组：再灌注前5min给予10-7mol/L胰岛素并于再灌注前10min给予10-9mol/LISO直至再灌注结束。
　　2.于左心室插入充水球囊，由多道生理记录系统连续采集左室压力指标，实时测量心脏收缩功能。于再灌注结束后用伊文氏蓝/TTC双染色法测定心肌梗死面积。于心肌缺血前15min、缺血30min末、再灌注1h、再灌注2h分别收集冠脉流出液，用分光光度法测定肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）活性。DNAladder方法和TUNEL原位法分别定性和定量测量心肌细胞凋亡。
　　3.取再灌注后心肌组织，制备心肌细胞肌浆网膜蛋白以测定Ca2+-ATPase活性。WesternBlot检测SERCA2a蛋白表达水平、PLB及磷酸。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

第一部分

1. 胰岛素概述

2. GIK极化液的临床应用及心肌保护机制

3. 急性心肌缺血与高血糖

4. 胰岛素心肌保护效应与血糖控制的关系

第二部分

1 缺血/再灌注概述

2. 心肌细胞内钙离子调节与MI/R损伤

3. 交感-肾上腺素能系统与AMI

4. 胰岛素心肌保护作用及对I/R心肌收缩功能的影响

5. 心肌β-AR与胰岛素信号系统互调的相关证据

正文

实验一 胰岛素血糖依赖性和非依赖性心肌保护作用及其机制研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 创新点与不足

实验二 胰岛素抗肾上腺素能心肌保护新机制的研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 创新点与不足

小结

参考文献

个人简历

致谢