Plin5在小鼠压力负荷性心力衰竭发生过程中的作用及初步机制研究

摘要

心力衰竭（Heart failure,HF）是由各种疾病引发的心肌收缩功能减弱，使心脏泵出的血液量减少，无法搏出静脉回流和身体组织代谢需要的血液供应，以及由此产生的一系列症状和体征，是各种心血管疾病的共同结局。压力负荷过重是导致心力衰竭的重要原因。在正常的情况下，心脏的大部分能量来源于脂肪酸氧化，但是在心衰发生时，心肌细胞的能量代谢过程发生明显的变化，脂肪酸的代谢也出现明显异常。同时，心脏脂肪酸β氧化的改变能够导致心肌能量代谢异常，与心力衰竭的发生密切相关。
　　目前，细胞内脂滴（Lipid droplets,LD）目前被认为是一个参与能量代谢的“细胞器”，能够储存脂质并在脂质代谢过程中起着非常重要的作用，与很多代谢性疾病的发生发展有关。脂滴中的脂滴表面蛋白是一类参与脂滴代谢调节的分子，其中，PAT家族最为重要，Plin5是现阶段发现的第5个PAT家族的成员，主要表达于氧化代谢比较活跃的组织中，例如心脏、肝脏、骨骼肌和褐色脂肪组织（Brown Adipose Tissue，BAT）等，又被称为MLDP（Myocardial lipid droplet protein）、LSDP5（Lipid storage droplet protein5）、Perilipin5，或OXPAT。Plin5在心脏组织中表达水平最高，Plin5缺失能够加快脂解作用以及脂肪酸氧化速度，从而造成心脏和肝脏的脂毒性损伤。
　　本实验在Plin5敲除小鼠模型的基础上，通过升主动脉缩窄术（Transverse aortic constriction,TAC），建立心衰的动物模型，来研究Plin5在压力负荷性心衰发生过程中的作用及可能的分子机制，为心衰的治疗提供参考。
　　1、Plin5缺失加重TAC诱导的小鼠心肌肥大以及心脏功能的下降。
　　8周龄的野生型和Plin5敲除小鼠分别进行升主动脉缩窄术（TAC）。术后四周取各组小鼠心脏，计算小鼠心脏重量（Heart weight,HW）/小鼠整体重量（Body weight，BW）。同时，对小鼠心脏进行HE染色，采用CellSens Entry软件随机选择5个不同视野，计算心肌细胞横截面积。结果显示，TAC术后，Plin5敲除小鼠HW/BW相比野生组明显升高，而且Plin5敲除小鼠心肌细胞横截面积相比野生组明显增大。这些结果提示，Plin5缺失加剧TAC诱导的小鼠心肌肥厚。
　　TAC术后四周，应用超声仪及高频探头行经胸二维心脏超声检查(M模式)获得野生型和Plin5敲除小鼠的心动图，分别测定左室收缩末期内径(Left ventricular systolic internal dimension,LVID;S）,左室射血分数（Ejection fraction,EF)，左心室短轴缩短率（Fractionshortening,FS）。结果显示，Plin5缺失加剧TAC诱导的左心室收缩末期心室腔扩张程度，并导致心脏功能明显下降。
　　2、Plin5缺失降低心脏中脂滴储存降低，并增加了非酯化脂肪酸的水平。
　　TAC术后四周，取各组心脏组织，行油红O染色，结果显示Plin5缺失小鼠心肌中脂滴含量明显降低；心肌组织的甘油三酯（Triglyceride，TG）定量分析显示，Plin5敲除小鼠导致心肌组织中TG含量明显下降，而游离脂肪酸（FFA）的水平却高于野生型小鼠，但野生型小鼠和Plin5敲除小鼠血清中FFA未出现明显变化。TAC术后，小鼠心肌组织内脂滴数量和TG含量，以及心肌组织和血中游离脂肪酸（FFA）水平也出现类似的变化。这些结果表明，Plin5缺失能够降低心肌组织内脂肪的储积，而增加游离脂肪酸水平。
　　3、Plin5缺失导致小鼠心肌组织中线粒体数量增多，并且加剧TAC术后的心肌过氧化损伤。
　　取TAC术后四周小鼠心室组织，利用透射电镜观察心肌组织超微结构，结果发现，Plin5缺失增加小鼠心肌细胞中的线粒体数量，而且TAC术后Plin5缺失小鼠心肌细胞中线粒体数量也明显多于野生型小鼠，尽管TAC术造成心肌细胞线粒体数量的减少。WesternBlot结果显示，线粒体中重要分子CoxIV以及Cytochrome C水平升高，且Real-timePCR也显示CoxIV以及Cytochrome CmRNA水平升高，表明线粒体数量增加，与电镜观察的结果一直。TAC术后，Plin5敲除小鼠的心肌组织中CoxIV和Cytochrome C的蛋白和mRNA水平均出现降低，与野生型小鼠类似。以上结果说明，Plin5缺失能够增加心肌组织中线粒体的数量。
　　TAC术后4周，取各组小鼠心脏组织，检测各组小鼠心肌组织中的MDA,SOD以及ROS水平。研究结果发现，在假手术组中，Plin5缺失小鼠心脏组织中MDA含量略高于野生小鼠，而TAC术后Plin5缺失心肌组织中MDA水平明显升高；在假手术组，Plin5缺失小鼠心肌内SOD的活性没有明显差异，而在TAC术后Plin5缺失小鼠心脏组织中SOD活性明显降低；在假手术组中，尽管Plin5缺失小鼠心肌组织ROS含量相对于野生型小鼠没有明显变化，但在TAC术后，Plin5缺失小鼠心脏组织中ROS含量明显高于野生小鼠。结果表明，Plin5缺失加剧了TAC导致的心脏过氧化损伤。
　　4、Plin5缺失加剧了TAC引起的小鼠心肌中PGC-1α与PPARα表达水平升高的程度。
　　TAC术后4周，取各组心室组织，Western Blot测定各组小鼠心肌中PGC-1α与PPARα的表达水平，结果显示，TAC术后，Plin5敲除和野生型小鼠心肌中PGC-1α与PPARα的表达水平相比假手术组均有明显升高，而Plin5敲除小鼠的升高更加显著。同时，Real-time PCR检测Plin5敲除和野生型小鼠心肌中PGC-1α与PPARα表达水平，发现结果与Western Blot基本一致。这些结果显示，TAC术后，小鼠心肌中PGC-1α与PPARα的表达水平升高，同时，Plin5缺失加剧了TAC引起的小鼠心肌中PGC-1α与PPARα表达水平升高的程度。
　　本研究利用升主动脉缩窄术（TAC）研究了Plin5敲除小鼠压力负荷性心衰的发生过程，以明确Plin5在压力负荷性心衰发生过程中的作用。研究结果显示，Plin5缺失加剧TAC诱发的小鼠心肌肥厚程度以及左心室收缩末期心室腔的扩张，导致心脏功能下降。进一步的研究发现，Plin5缺失降低了心脏中脂滴的储存，并激活PPARα活性，增加线粒体数量，使脂肪酸的氧化速率加快。脂肪酸氧化速度的增加导致心肌细胞内产生过量的ROS，从而导致心肌的脂毒性（Lipotoxicity）损伤，加快了TAC导致的小鼠心衰程度。这些结果提示，Plin5缺失小鼠心肌中脂滴含量明显减少，刺激PGC-1α以及PPARα表达水平升高，从而调节脂肪酸氧化中的关键分子，使线粒体增值，脂肪酸氧化速度加快，产生大量的ROS，进而引发心肌细胞的氧化损伤，加重TAC导致的心脏损伤。这些结果对明确Plin5在心肌中的功能，以及脂肪代谢异常在心衰发生过成汇总的作用具有重要的意义。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1. 心衰发生过程中心肌的能量代谢变化

2. 心衰发生过程中心肌能量代谢的调控

3. 脂滴与脂滴表面蛋白

4. Plin5与心脏脂肪代谢

5. 小结

第一部分 Plin5缺失对小鼠压力负荷性心脏损伤的影响

引言

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4讨论

第二部分Plin5在心衰发生对心脏中脂肪酸氧化的影响

引言

1 实验材料

2 实验方法

3实验结果

4 讨论

第三部分Plin5缺失加剧心衰的作用机制研究

引言

1 实验材料

2 实验方法

3实验结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢