20S蛋白酶体参与人骨髓间充质干细胞复制性衰老进程

摘要

目的：通过观察人骨髓间充质干细胞(human bone marrow stromal cells，hBMSCs)的复制性衰老进程以及衰老进程中hBMSCs的生物学特征变化，探讨20S蛋白酶体在hBMSCs复制性衰老进程中的调控作用，从而揭示hBMSCs复制性衰老的机制，以期为hBMSCs的临床应用提供指导依据。
　　 方法：体外培养hBMSCs，依据传代次数将细胞分为早期组(1～3代)、中期组(7～9代)和晚期组(12～14代)：(1)倒置相差显微镜下观察不同时期细胞形态特征，β-半乳糖苷酶染色鉴定细胞衰老进程，噻唑蓝(MTT)比色分析法和溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine，BrdU)掺入实验检测细胞增殖能力。(2)免疫荧光染色观察20S蛋白酶体在hBMSCs复制性衰老进程中的表达变化。(3)将10μM蛋白酶体特异性抑制剂MG132作用于早期hBMSCs，每日作用2 h，反复刺激4 d，随后通过β-半乳糖苷酶染色，观察衰老标志物β-半乳糖苷酶的表达变化，并应用MTT比色法和BrdU掺入实验检测细胞增殖活性，检测蛋白酶体抑制剂对早期hBMSCs增殖能力的影响。
　　 结果：(1)早期hBMSCs胞体较小、核仁清晰，细胞呈梭形，似成纤维细胞样外形。伴随体外传代次数增多hBMSCs胞体变大、突起增多，细胞折光度降低，胞浆内出现许多细小颗粒，细胞粘附能力增加，生长速度减慢。衰老标志物β-半乳糖苷酶染色结果显示，早期、中期和晚期组阳性细胞率分别为9％±7％，54％±8％，90％±8％，三组之间比较p＜0.05，提示体外培养的hBMSCs存在复制性衰老。MTT比色法检测不同培养阶段hBMSCs细胞活力早期组OD值为0.61±0.04，中期组为0.53±0.05，晚期组为0.37±0.03，三组之间比较p＜0.05，表明在复制性衰老进程中细胞活力显著降低，同时BrdU掺入实验结果也表明晚期组细胞BrdU阳性率(8％±2％)较早期组(73％±11％)显著降低，且p＜0.05，进一步表明在复制性衰老进程中hBMSCs增殖活力降低。(2)免疫荧光染色结果显示hBMSCs表达20S蛋白酶体，早期组与中期组20S蛋白酶体阳性率为100％，然而晚期细胞20S蛋白酶体表达水平降低，其阳性率降至31％，提示蛋白酶体活性降低可能与hBMSCs复制性衰老有关。(3)早期hBMSCs经MG132作用后β-半乳糖苷酶染色增强，β-半乳糖苷酶阳性率达87％±13.2％，较DMSO组(对照组)(19％±6.8％)明显升高，且p＜0.05，MTT检测结果证实MG132组OD值(0.36±0.06)较DMSO组(0.47±0.08)显著降低，且p＜0.05，并且Brdu掺入实验也显示MG132组Brdu阳性率(7％±2％)较对照组(54％±4％)明显降低，且p＜0.05，表明蛋白酶体抑制剂可诱导早期hBMSCs出现衰老细胞的表型，进一步说明蛋白酶体活性降低与hBMSCs复制性衰老有关。
　　 结论：(1)体外培养的hBMSCs存在复制性衰老；(2)20S蛋白酶体在hBMSCs复制性衰老进程中表达水平降低。(3)应用蛋白酶体特异性抑制剂可诱导hBMSCs呈现衰老细胞的表型，提示蛋白酶体活性降低可能是导致hBMSCs衰老的重要原因。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

前言

材料和方法

1.材料与试剂

2.实验方法

3.图像分析和统计学处理

结果

1.细胞形态及生长曲线

2.SA-β-gal染色(细胞衰老检测试剂盒)

3.MTT比色法

4.BrdU免疫荧光染色

5.20S蛋白酶体免疫荧光染色

6.MG132处理后hBMSCs衰老表型检测

讨论

1.细胞的复制衰老

2.蛋白酶体概述及其对细胞衰老的调控机制

3.蛋白酶体抑制剂在细胞衰老过程中的可能机制

全文小结

附图

参考文献

综述：泛素—蛋白酶体通路及其抑制剂的研究进展

个人简历

致 谢