鳗弧菌金属蛋白酶在大肠杆菌中表达、加工与转运及重组蛋白酶的纯化与性质研究

摘要

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是一种对水产鱼类危害严重的细菌病原，流行区域广泛，可感染多种鱼类，常给水产养殖业造成巨大的经济损失。鳗弧菌的致病性与许多毒力因子有关，包括胞外蛋白酶、由质粒编码的铁吸收系统、细胞外溶血毒素、细菌鞭毛蛋白等。研究发现胞外蛋白酶是重要的致病因子之一，参与了细菌入侵宿主的毒力机制。 鳗弧菌金属蛋白酶全基因ORF编码611个氨基酸的前体前蛋白，包含有四个结构域：信号肽、N-末端的前体肽、成熟区(蛋白酶区)和C-末端延伸区；在随后的分泌过程中切除信号肽和前体肽形成成熟蛋白，分泌到细胞外的成熟蛋白分子量是36kDa，具有活性的蛋白分子量是45 kDa，或者47 kDa。 为了更好地研究：EmpA的表达与加工，本研究将empA基因克隆到阿拉伯糖诱导表达载体pBAD24上，构建重组表达载体pBAD-VAP，在大肠杆菌TOPlO中通过加入阿拉伯糖诱导EmpA表达，重组蛋白通过SDS-PAGE和Immunoblotting鉴定分子量为36kDa，与从鳗弧菌细胞培养基上清中纯化的蛋白分子量完全相同，分子量为36kDa的重组蛋白N-端6个氨基酸序列同Milton等报导的成熟EmpA以及前体蛋白全长序列中从200到205氨基酸序列一致，也与根据全长序列推测的44.6kDa蛋白的N-端序列一致，说明重组蛋白的C-端存在大约9 kDa多肽的加工，并发现加热促进蛋白的C-端9kDa多肽的加工，使44.6kDa的蛋白加工成36kDa的成熟蛋白。 将重组表达载体pBAD．VAP转入大肠杆菌MC4100A(Wt)、Cul64A(SecY缺陷型)和B1LKOA(tat缺陷型)中，通过诱导表达EmpA，研究蛋白的转运与加工过程。研究发现，EmpA在大肠杆菌中通过sec途径转运，转运到细胞周质中，在细胞周质中的活性蛋白是相同的分子量(44.6 kDa)构象不同的两种蛋白。有趣的是，在细胞的原生质中，聚集的蛋白前体能够转变成有活性的蛋白酶。当样品加热时，44.6kDa的EmpA C-端进一步加工，这种加工过程不同于鳗弧菌相同的蛋白和一些同源的锌．蛋白酶。研究发现，蛋白的加工受其它蛋白的辅助，而本研究显示：EmpA加工和活化与蛋白的分泌相分离，无需鳗弧菌其它蛋白的辅助。 将empA基因全长通过在反义引物的3端设计编码6个组氨酸的核苷酸序列，通过PCR方法将基因克隆到表达载体pBAD24上，表达的融合蛋白的C-端带有His标签，然后用6X组氨酸一步法纯化试剂盒纯化融合蛋白。纯化的重组蛋白最适温度是37℃，最适pH为8.0。纯化的重组酶对热不稳定，只有在30℃以下稳定，pH的稳定范围是从5.0到8.0。金属离子Ca<'2+>、Na<'+>和Mg<'2+>对重组酶有激活作用，而Zn<'2+>和Cu<,2>却可抑制该酶的活性，酶抑制剂1，10-Phenanthroline(1，10-菲珞啉)、。EDTA和EGTA对重组酶有抑制作用。SDS-PAGE和Immunoblotting检测纯化的蛋白分子量为36 kDa，与从鳗弧菌中纯化的蛋白分子量一致。另外纯化的重组酶能消化多种蛋白，如明胶、胶原蛋白与虾蛋白，表明该蛋白具有潜在致病性。

目录

文摘

英文文摘

第一章绪论

第二章鳗弧菌金属蛋白酶在大肠杆菌中的诱导表达及其酶活性研究

第三章鳗弧菌金属蛋白酶在大肠杆菌中的加工与转运的研究

第四章鳗弧菌金属蛋白酶在大肠杆菌中的表达、纯化及重组酶性质研究

总结与创新点

附录

攻读博士学位期间发表的文章

致谢