马克斯克鲁维酵母菌乳糖酶基因的高效表达和高活力乳糖酶的生产

摘要

β-半乳糖苷酶又叫乳糖酶,可以催化乳糖水解,同时具有半乳糖苷转移作用,在食品工业和乳清的生物降解等方面用途广泛。马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)具有酶活高、耐热性好、生产周期短、抗逆性强等优点。该酵母所产的乳糖酶被认为是对人体安全无害的,因此马克斯克鲁维酵母十分适合乳糖酶的工业化生产。
　　微生物中普遍存在葡萄糖阻遏作用,当有葡萄糖存在时,许多酶的合成和基因表达都会受到抑制。K.marxianus酵母乳糖酶的合成就会受到葡萄糖阻遏作用的影响而导致发酵周期延长、酶产量降低和原料浪费等问题。在葡萄糖阻遏作用中,由MIG1基因所编码的Mig1蛋白起着十分重要的作用。它在Snf1复合体的作用下直接控制着相关基因的转录。本研究对K.marxianus kmi菌株的MIG1基因进行了敲除,解除该菌株的葡萄糖阻遏,经筛选获得一株高产乳糖酶的葡萄糖解阻遏突变株kmi-17。经PCR和2-脱氧-D-葡萄糖培养基验证,该菌株的葡萄糖阻遏确实已经解除。筛选结果和荧光定量PCR结果均证明该菌株乳糖酶产量高于野生型kmi菌株。对kmi-17菌株进行进一步的摇瓶发酵和10-L发酵罐发酵实验,确定摇瓶发酵最佳发酵时间为48h,最高乳糖酶产量为131.2U/mL,比野生型kmi菌株高出62.5％;10-L发酵罐发酵最佳时间为24h,最大乳糖酶产量154.3U/mL,比摇瓶发酵高出17.6%。以上结果均表明K.marxianus kmi-17菌株在乳糖酶的工业化生产方面具有很高的潜力。
　　转录激活蛋白是一类特殊的反式作用因子,它可以识别DNA序列上的特异核苷酸顺序并与之结合,进而激活基因表达。有研究表明乳酸克鲁维酵母的LAC9基因作为正调因子调节乳糖酶基因的表达,因而推测马克斯克鲁维酵母的乳糖酶转录激活蛋白基因LAC9p1同样具有促进乳糖酶基因表达的作用。本研究对K.marxianus kmi菌株的乳糖酶转录激活蛋白基因LAC9p1进行敲除并测定敲除菌株的乳糖酶活力及基因转录水平,摇瓶发酵和荧光定量PCR实验结果均表明,LAC9p1基因敲除菌株的乳糖酶基因转录水平和乳糖酶产量相比于原始kmi菌株都有所下降。由此可见LAC9p1基因所编码的Lac9p1蛋白具有促进乳糖酶基因表达的作用。构建了LAC9p1基因表达载体pMD-rDNA-G418-LAC9,并对葡萄糖解阻遏突变株K.marxianus kmi-17进行了转化,筛选出了一株乳糖酶产量更高的LAC9p1基因超表达菌株kml-1。荧光定量PCR证明该菌株的LAC9p1基因和乳糖酶基因的转录水平均高于kmi-17菌株和野生型kmi菌株。对kml-1菌株进行进一步的摇瓶发酵和10-L发酵罐发酵实验,确定摇瓶发酵最佳发酵时间为48h,最高乳糖酶产量为150.5U/mL,比kmi-17菌株摇瓶发酵结果高出了14.4%。10-L发酵罐发酵最佳时间为24h,最大乳糖酶产量为205.4U/mL,比kmi-17菌株10-L发酵罐发酵结果高出33.1%。由此可见kml-1菌株在乳糖酶的工业化生产方面具有更高的潜力。

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第一章 文献综述

1.1 乳糖酶简介

1.2用于乳糖酶生产的微生物重组系统

1.3重组乳糖酶的应用

1.4酵母菌的葡萄糖阻遏作用

1.5 LAC9p1转录激活蛋白

1.6本论文研究的目的与意义

第二章 K. marxianus kmi菌株MIG1基因的敲除

2.0 引言

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第三章 葡萄糖解阻遏突变株乳糖酶的发酵生产

3.0 引言

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3实验结果及讨论

3.4 本章小结

第四章 乳糖酶转录激活蛋白基因LAC9p1的敲除及超表达对乳糖酶合成及其基因表达的影响

4.0 引言

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果与讨论

4.4本章小结

第五章 LAC9p1基因超表达菌株乳糖酶的发酵生产

5.0 引言

5.1 实验材料

5.2实验方法

5.3 实验结果与讨论

5.4 本章小结

论文总结及创新点

参考文献

附 录：英文缩写符号及中英文对照表

个人简历

致谢