四个脂肪沉积相关基因的多态性、表达特征及其与猪背膘厚的关系

摘要

猪是与人类关系最为密切的家畜之一，它与人们的日常生活息息相关。猪肉是世界上消耗量最大的肉类，猪肉产量及猪肉的品质在很大程度上关系着人们的正常生活。脂肪沉积的能力与猪的生长速度及猪肉品质有着密切的联系，本研究在以前工作的基础上对二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)基因、瘦素(leptin)基因及苹果酸酶1(ME1)基因在分子和蛋白水平上进行了研究。 DGAT酶是一种微粒体酶，催化二酰基甘油加上脂肪酸酰基形成三酰甘油(即甘油三酯)，是合成甘油三酯的限速酶。DGAT酶有两种类型DGAT1和DGAT2。两者的作用机制的差别尚未研究清楚。已发现DGAT1基因翻译起始位点(ATG)上游241bp处存在由于A碱基的缺失造成的SNP。本试验采用PCR-SSCP的方法分别对大白猪、杜洛克、长白猪、莱芜猪、大蒲莲猪、鲁莱黑猪和商品猪群体进行了基因型频率和基因频率的检测。x2检测显示除商品猪外其它猪种均处于Hardy-Weinberg平衡状态。将三种基因型与背膘厚进行了关联分析，并用荧光定量PCR的方法对不同基因型间mRNA的表达量进行了检测。结果显示，大白猪ins(A)/ins(A)与ins(A)/+之间背膘厚差异显著(P<0.05)，其它猪种各基因型间生产性状及mRNA表达的差异均不显著(P>0.05)，ins(A)等位基因有利于脂肪的沉积和mRNA的表达，可能是脂肪沉积的有利基因。 比较了杜洛克和莱芜猪成年猪和3日龄仔猪脂肪组织中DGAT1和DGAT2基因的表达量差别，结果显示同一时期杜洛克两种DGATs基因的表达水平高于莱芜猪，生长过程中莱芜猪DGATs基因表达量的增长高于杜洛克猪，各猪种DGAT2基因表达量的增长高于DGAT1基因。对揭示中西方猪种脂肪沉积机制的不同提供一定的理论基础。 Leptin基因是一个与摄食和能量代谢有关的基因，leptin基因敲除的ob/ob小鼠表现出肥胖的特征。Leptin通过作用于下丘脑的特殊受体OB-Rb来调节机体的摄食和能量代谢，从而影响脂肪的沉积。本研究发现猪的leptin基因启动子区-2825位点存在G→A的突变。PCR-SSCP的方法检测并计算了杜洛克、大白猪、莱芜猪、鲁莱黑猪和商品猪群体的基因型频率和基因频率，结果表明西方猪种以G等位基因为主，本地猪种中则以A等位基因为主，X2检测显示除鲁莱黑猪外，其它猪种均处于Hardy-Weinberg平衡状态。对有背膘厚记录的商品猪和鲁莱黑猪进行了G-2825A的多态性与生产性状的相关分析。荧光定量PCR的方法检测了不同基因型鲁莱黑猪脂肪组织中leptin基因mRNA的表达量。ELISA的方法检测了不同基因型鲁莱黑猪血清中leptin蛋白的表达量。无论是背膘厚、mRNA水平还是蛋白表达水平，三种基因型间差异均不显著，仅存在GG>GA>AA的趋势。推测这一位点的突变没有影响到leptin基因及其蛋白leptin的表达。 苹果酸酶1(ME1)是机体内源性脂肪酸合成的关键酶，可催化苹果酸氧化脱羧生成丙酮酸和CO2，并使NADP+还原成NADPH，而NADPH是脂肪酸合成及其碳链延长的重要辅酶。MEl5'调控区-1068位点存在A→G的突变，已有研究表明G等位基因有增加背膘厚的趋势，本试验用荧光定量PCR的方法在分子水平上检测不同基因型鲁莱黑猪脂肪组织中MEl mRNA表达水平的差别，结果显示等位基因G有增加MEl mRNA表达的趋势，接近显著水平(P=0.052)。 本研究的结果可为深入探讨猪脂肪沉积的原理，改善猪肉品质提供参考。

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文摘

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声明

引言

1影响猪脂肪沉积的基因

1.1甘油酰基转移酶(DGAT)基因

1.2瘦素(leptin)基因

1.3苹果酸酶1(ME1)基因

1.4脂肪酸结合蛋白(FABP)基因的研究概况

1.5黑素皮质素及其受体(MCRs)的研究概况

1.6脂蛋白酶(LPL)基因简介

2基因表达检测技术

2.1荧光定量PCR技术

2.2Northern杂交

2.3酶联免疫法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)

2.4 Western杂交

研究目的及意义

材料与方法

1试验材料

1.1试验动物和样品采集

1.2主要仪器

1.3酶和试剂

1.4主要数据库及生物软件

2试验方法

2.1常用试剂的配制

2.2背膘厚测定

2.3猪耳组织基因组DNA的提取

2.4聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.5猪脂肪组织总RNA的提取

2.6反转录获得cDNA

2.7荧光定量PCR

2.8统计分析

2.9转录因子结合位点分析

研究内容

1不同猪种DGAT1基因启动子区-241位点的多态性及其与猪背膘厚和mRNA表达水平的关系

1.1试验方法

1.2结果

1.3讨论

2猪背膘组织中DGAT1与DGAT2基因的发育性表达分析

2.1荧光定量PCR用到的引物

2.2结果

2.3讨论

3猪瘦素(leptin)基因5'调控区G-2825A位点的多态性检测及其与背膘厚和表达水平的关系

3.1试验方法

3.2结果

3.3讨论

4 ME1基因A-1068G位点多态性及其与mRNA表达水平的关系

4.1试验引物

4.2结果

4.3讨论

结论

参考文献

致谢