新洋葱伯克霍尔德氏菌菌株D-7突变体库的构建及GidA基因功能分析

摘要

植物根际促生细菌（Plant Growth Promoting Bacteria,PGPB）是植物病害生物防治的重要资源，研究PGPB的抗菌活性、环境耐受性及相关基因对深入了解其防病作用及促生机理具有重要意义。本研究从大豆根际土壤中分离到一株对多种病原菌具有拮抗活性的菌株D-7，在对其种属和生物特性进行分析基础上，构建了菌株D-7的随机插入突变体库，并对突变体及野生株的生物学特性、环境耐受性等进了比较分析，取得的主要研究结果如下： 1.拮抗菌株的筛选及其拮抗活性分析。以尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）为指示菌筛选到一株对两个病原菌皆有拮抗活性的菌株D-7。抑菌活性分析，菌株D-7对多种植物病原真菌、细菌、卵菌均具有明显的拮抗活性，其中菌株D-7对姜茎基腐病菌（Pythium myriotylum）、青枯劳尔氏菌（R.solanacearum）的抑菌圈半径均大于1.5cm，对尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、禾谷镰孢菌（F.graminearum）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）的抑菌半径小于1cm。 2.菌株D-7的种类鉴定。利用系统进化分析软件MEGA6.06对菌株D-7的RecA基因进行系统进化分析，发现菌株D-7与Burkholderia cenocepacia DQ664181和B.cenocepacia NC008060.1位于同一个分支，表明菌株D-7属于B.cenocepacia，其中菌株D-7的RecA基因在NCBI中的登录号为MF964231。 3.菌株D-7毒性基因及致病性检测。从毒性基因检测、苜蓿模型实验及洋葱致病性测定等方面，分析了菌株D-7对动、植物的安全性。PCR检测发现，菌株D-7中不含有BCESM基因和cblA基因。经苜蓿和洋葱致病性测定发现，菌株D-7对模式植物苜蓿和洋葱均无致病性。 4.菌株D-7突变体构建及抗菌物质合成基因分析。为了解菌株D-7的抗菌物质合成相关基因，首先，用转座子EZ-Tn5构建了D-7随机突变体库。平板对峙法初步筛选出对F.oxysporum抑菌活性减弱的突变株10株。质粒拯救法结合序列分析发现，10个突变株中Tn5的插入基因及位点分别位于6个基因，其中MT1393、MT720等5个突变体的插入位点位于同一基因的不同位点，序列比较发现，该基因编码葡萄糖抑制的分裂蛋白A（glucose-inhibited division protein A，GidA），其余5株突变体的插入位点分别位于不同基因，包括糖基转移酶（Glycosyl transferase）、Ⅱ型分泌系统蛋白（typeⅡsecretion system protein）等蛋白的编码基因。 为分析突变基因与抗菌活性之间的关系，选择突变体MT1393进行互补分析。结果表明，互补菌株MS1393部分恢复了MT1393对F.oxysporum的抑菌活性，说明GidA基因与菌株D-7拮抗真菌的活性有关。 5.突变体MT1393生物学特性分析。通过比较野生株、突变体和互补菌株的生物膜表型发现，野生株D-7和互补菌株MS1393在Leica体视镜下表面光滑，而突变体MT1393菌落表面不光滑，有点状凸起。 同时对野生株、突变体、互补菌株的生物膜相对产量进行测定，发现，突变体MT1393在蔗糖丰富的培养基中生物膜产量明显降低，而在葡萄糖丰富的培养基中与野生菌株相比没有明显的差异，而互补菌株的生物膜相对产量则降低至野生菌株的水平。 对各菌株胞外多糖产量分析发现，不管是在葡萄糖丰富还是蔗糖丰富的培养基中，突变体MT1393胞外多糖的产量比野生菌株均明显增加一倍以上，同时互补菌株胞外多糖的产量降低至野生菌株的水平。 菌落直径法比较测定了野生株、突变体、互补菌株的运动能力，结果发现，在0.6%琼脂的NY平板上培养3d后，野生菌株D-7和突变株MT1393的菌落直径分别为1.93cm和1.83cm，而互补菌株MS1393的菌落直径与突变株MT1393相近（1.84cm），表明互补菌株的swarming能力不能完全恢复至野生菌株的水平；在0.3%琼脂的LA平板上培养3d后，野生菌株D-7和突变体MT1393的菌落直径为2.35cm和1.81cm，而互补菌株菌落直径为1.93cm，表明互补菌株的swimming能力不能恢复至野生菌株的水平。 环境耐受性是PGPB菌株能否适应复杂环境并发挥生防作用的重要指示，从5个方面比较了野生株D-7、突变体MT1393和互补菌株MS1393对环境的耐受力，结果发现，在蔗糖丰富的培养基中，突变体MT1393对高温、高盐、酸性环境的耐受力比野生株明显降低，而对SDS和紫外光处理没有显著变化，MS1393则部分恢复了在胁迫环境下的耐受性；在葡萄糖丰富的培养基中，突变体MT1393在5种处理下的生长能力与野生菌株没有明显差异，表明两种糖对GidA基因参与耐受性的影响不同。上述结果表明，GidA基因不仅与D-7抗菌活性有关，而且可参与菌株的生物膜形成及其对环境的耐受性。

目录

声明

英文缩略词及中英文对照表

1 前言

1.1伯克霍尔德氏菌研究进展

1.1.1洋葱伯克霍尔德氏菌概述

1.1.2洋葱伯克霍尔德氏菌抑菌作用机制及抗菌物质合成基因研究进展

1.1.3洋葱伯克霍尔德氏菌的安全性检测

1.2细菌生物膜及其调控基因研究进展

1.2.1 细菌生物膜

1.2.2 GidA蛋白研究进展

1.3细菌基因功能分析方法

1.3.1转座子插入突变

1.3.2基因敲除技术研究进展

1.4本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1试验材料

2.1.1 土壤样品

2.1.2 供试菌株、质粒和试剂盒

2.1.3 培养基组分及配方

2.1.4 生化及分子生物学试剂

2.1.5主要实验仪器

2.1.6 引物设计与合成

2.2 试验方法

2.2.1拮抗菌株的分离与保存

2.2.2拮抗细菌抑菌活性测定

2.2.3拮抗细菌菌株的鉴定

2.2.4菌株毒性基因检测及对植物安全性测定

2.2.5 电转化感受态细胞的制备及转化

2.2.6 菌株突变体的筛选鉴定

2.2.7 突变体突变基因功能互补

2.2.8 野生株、突变体及基因功能互补菌株的生物学功能分析

2.2.9 GidA基因缺失突变体的构建

3结果与分析

3.1菌株D-7的种类鉴定和抑菌作用分析

3.1.1 菌株D-7的抑菌能力测定

3.1.2基于RecA的序列分析

3.2菌株D-7毒性检测

3.2.1菌株D-7毒性基因的检测

3.2.2菌株D-7对苜蓿的致病性检测

3.2.3菌株D-7对洋葱鳞茎的致病性检测

3.3突变体的筛选和验证

3.3.1突变体的筛选

3.3.2突变体的验证

3.3.3部分突变菌株生物学功能测定

3.4突变体MT1393突变基因互补

3.4.1 GidA基因的PCR扩增

3.4.2 重组克隆载体的构建及验证

3.4.3重组互补载体的构建及验证

3.4.4基因功能互补菌株MS1393的筛选及验证

3.5 野生株、突变体、互补菌株生物学特性分析

3.5.1 野生株、突变体、互补菌株生物膜表面形态观察

3.5.2 野生株、突变体、互补菌株生物膜相对含量测定

3.5.3 野生株、突变体、互补菌株菌膜厚度的变化

3.5.4野生株、突变体、互补菌株胞外多糖产量的变化

3.5.5野生株、突变体、互补菌株运动性的变化

3.5.6野生株、突变体、互补菌株抗逆性的变化

3.6 GidA基因缺失突变菌株的构建及相关特性的研究

3.6.1上下游片段A和B的PCR扩增

3.6.2上下游片段 A和B的融合

3.6.3重组克隆载体AB-PMD19的构建及验证

3.6.4 PSL15质粒的单酶切与AB-PMD19质粒的单酶切

3.6.5重组克隆载体AB-nptII-PMD19的构建及AB-nptII片段的回收

3.6.6 GidA缺失突变体的筛选及PCR验证

3.6.7 Southern blot 验证

3.6.8 缺失突变体相关特性的研究

4.讨论

4.1 菌株D-7的分离鉴定及其安全性检测

4.2 菌株D-7的安全性检测

4.3 菌株D-7抗菌机制相关研究

4.4 突变体生物学特性研究

5.结论

参考文献

致谢

攻读学位期间论文发表情况