N-糖基化和经典Wnt信号通路促进Cthrcl的表达及其促进口腔癌细胞转移的功能

摘要

背景和目的:
　　 Cthrc1首先在受伤的大鼠血管中发现，它是一种分泌型的糖基化蛋白，具有抑制胶原表达和促进细胞运动的功能。在TGF-β家族的成员(BMP4，BMP2，TGF-β)的影响下，Cthrc1在纤维母细胞和软骨细胞中的表达升高。Cthrc1也跟很多重要的信号通路有关系，比如Wnt和TGF-β。体内外实验模型都证明了Cthrc1抑制TGF-β信号通路的功能是通过减少Smad2和Smad3的磷酸化实现的。Cthrc1在肿瘤的发生和转移中的表达升高，但是它在其过程中的作用还不清楚。最近的研究证明Cthrc1可以激活Wnt/PCP信号通路，它是非经典Wnt途径的一种。Cthrc1的激活状态是一种锚在细胞膜表面的一种N末端糖基化的三聚体。虽然Cthrc1在肿瘤的发生发展中的表达升高，但是其过表达的机制和其在病理过程中的功能还不清楚。
　　 Wnt/PCP信号通路在恶性肿瘤的发展中起着复杂的作用。在恶性肿瘤的早期阶段，Wnt/PCP通过抑制Wnt/β信号通路来抑制肿瘤的发展。随着肿瘤的成长，在肿瘤的晚期阶段，Wnt/PCP被激活并且可以促进肿瘤细胞的转移和侵袭，从而促进了肿瘤的转移。先前的研究证明了Wnt/β信号通路在口腔鳞状细胞癌中是激活的状态。并且我们过去的研究也报道了，在口腔鳞状细胞癌中E-cadherin的大量的N末端糖基化引起的细胞之间粘附的松解。E-cadherin的过度的糖基化又是由于DPAGT1的过表达引起的，DPAGT1是N末端糖基化的重要的调节基因。然而，我们近期的研究显示，DPAGT1基因又是经典Wnt信号通路的靶基因。经典Wnt信号通路的激活能够导致Wnt蛋白的N末端糖基化的增加，例如Wnt3a和LRP5/6，并且能够通过这个正反馈环引起DPAGT1的进一步高表达。这个反馈环的不适当的激活就能够促进口腔鳞状细胞癌的增值。
　　 Cthrc1是分泌型的糖基化蛋白，所以我们可以推测，Cthrc1在口腔鳞状细胞癌中的过表达或许是DPAGT1和Wnt/β信号通路形成的这个反馈环作用的结果。并且，Cthrc1可能在口腔鳞状细胞癌中通过激活Wnt/PCP信号通路来促进肿瘤细胞的迁移和肿瘤的转移。
　　 方法:
　　 在口腔鳞状细胞癌肿瘤标本和人舌鳞状细胞癌细胞Cal27中我们用western blot和免疫荧光的方法检测了Cthrc1和DPAGT1的蛋白水平的表达。对Cthrc1进行了去糖基实验。在cal27细胞中，我们沉默掉DPAGT1基因，然后检测了Cthrc1蛋白的表达水平。染色质免疫沉淀实验检测了在Cthrc1启动子上β-catenin和TCF的结合位点。在Cal27细胞中我们沉默掉Cthrc1基因，然后进行了细胞移动实验和刮伤愈合实验。
　　 结果:
　　 在口腔鳞状细胞癌中Cthrc1表达升高。Cthrc1在很多人类实性肿瘤中表达升高，所以我们在肿瘤标本和肿瘤的临近正常上皮组织中用western blot和免疫荧光的方法检测了其蛋白表达水平。Cthrc1的表达在肿瘤组织中比正常组织中有非常显著的增高。在免疫荧光的结果中我们看到，在肿瘤上皮岛中表达升高，而在正常组织中几乎没有表达。过去的研究表明，Cthrc1的激活状态是一个锚在细胞膜上的N末端糖基化的三聚体，并且N末端的糖基化对其锚在细胞膜上起着重要的作用。所以我们在肿瘤标本及正常组织中用western blot和免疫荧光的办法检测了DPAGT1的表达，发现DPAGT1在肿瘤组织里的表达远远超过正常组织。并且在免疫荧光中我们看到，在正常上皮组织中DPAGT1仅仅在基底层表达，而在肿瘤组织中则是整个肿瘤上皮岛都有高表达。Cthrc1是糖基化蛋白，所以我们进行了去糖基实验，发现Cthrc1的激活状态确实有N末端糖基修饰。
　　 N末端糖基化能够增加口腔鳞状细胞癌中Cthrc1蛋白的稳定性。有研究证明N末端糖基化增加了Cthrc1的分泌，也是其锚在细胞膜上的重要因素。为了搞清楚N末端糖基化在Cthrc1过表达中起的作用，我们在cal27细胞中沉默掉了DPAGT1基因，从而使得N末端的糖基化减少。这样我们发现在沉默掉DPAGT1基因的cal27细胞中的Cthrc1的蛋白水平严重下降。随后我们用环已酰亚胺处理了经DPAGT1 siRNA转染的cal27细胞及其对照组，我们发现N末端的糖基化使Cthrc1的半衰期增加，也就是增加了其稳定性。所以我们认为这可能是Cthrc1在口腔鳞状细胞癌中高表达的一个原因。
　　 经典Wnt信号通路的激活也是口腔鳞状细胞癌中Cthrc1高表达的促进因素。我们过去的研究表明，在口腔鳞状细胞癌中DPAGT1与经典Wnt信号通路形成了一个正反馈的作用环。在我们的实验中，经过Wnt3a条件培养基培育过的cal27细胞的Cthrc1的表达水平增加。随后我们在染色质免疫沉淀实验中发现在Cthrc1的启动子上有β-catenin和TCF的结合位点。众所周知，β-catenin处在经典Wnt信号通路的最末端，TCF又是β-catenin的靶基因。所以经典Wnt信号通路的激活能够使Cthrc1的表达升高。这也许是口腔鳞状细胞癌中Cthrc1蛋白表达升高的另一种机制。
　　 Cthrc1促进了口腔鳞状细胞癌的迁移。我们大量的观察发现，利用DPAGT1cDNA上调Cthrc1表达之后，在刮伤愈合实验中伤口边缘的Cthrc1表达增多和伤口愈合加快，这都说明Cthrc1可能具有促进了细胞迁移的功能。因此我们在Cal27细胞中沉默掉Cthrc1，进行了细胞移动实验和刮伤愈合实验。在细胞移动实验中沉默组细胞移动率比对照组明显降低，在刮伤愈合实验中沉默组愈合速度比对照组明显减慢。这些结果表明在Cal27细胞中Cthrc1是具有促进细胞迁移的功能的。
　　 DPAGT1转染的CAL27细胞中的Cthrc1在迁移的边缘位置表达升高的特点说明了Cthrc1的促进细胞迁移的功能是依赖于Wnt/RhoA信号通路的。确实如此，继western blot之后免疫沉淀实验表明Cthrc1与Wnt/PCP的配体Wnt5a，受体Fzd6有相互的结合作用。并且，Wnt5a在肿瘤中表达水平比正常组织中有明显的增高。所以，这些都说明在口腔鳞状细胞癌中，Cthrc1可能通过一个非经典Wnt信号通路Wnt/PCP信号通路来促进细胞的迁移。
　　 结论:
　　 我们的结果证明了N末端糖基化和经典Wnt信号通路的激活能够引起Cthrc1的表达升高，也就是DPAGT1与Wnt/β信号通路形成的反馈环的异常激活能够导致Cthrc1在口腔鳞状细胞癌中的异常高表达。
　　 结果也间接的说明，Cthrc1可能通过Wnt/PCP信号通路在口腔鳞状细胞癌的晚期促进癌细胞的迁移，从而导致肿瘤的转移。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分 Ror2在口腔鳞状细胞癌中的表达水平取决于肿瘤的不同的阶段

材料与方法

结果

讨论

参考文献

数据

致谢

博士期间发表论文情况

Ror2 may be downregulated in oral squamous cell carcinoma

N-glycosylation and canonical Wnt signaling cooperate to induce CTHRC1 and drive oral cancer cell migration

Silencing Heat Shock Protein 27(Hsp27)decreases metastatic behavior of human head and neck squamous cell cancer cells in vitro