黄翅大白蚁肠道微生物多样性及几丁质降解微生物的分离与鉴定

摘要

白蚁能够高效降解木质纤维素，其降解木质纤维素的速率超过了木腐真菌和其他的食草动物。白蚁肠道中存在多种共生微生物，根据白蚁后肠有无鞭毛虫，将白蚁分为低等白蚁（有鞭毛虫）和高等白蚁（无鞭毛虫）两大类。高等白蚁根据食性分为食木/草白蚁、食土/腐殖质白蚁和培菌白蚁。
　　培菌白蚁属于大白蚁亚科，其在菌巢中培养真菌鸡枞菌。在干旱的热带地区培菌白蚁可以降解90％以上的木质材料，所以培菌白蚁在碳循环中具有重要的作用。培菌白蚁和许多的微生物共同进化，不仅包括具有木质纤维素降解能力的鸡枞菌，还包括肠道共生微生物以及菌巢中的细菌。白蚁-真菌-共生微生物系统将木质纤维素彻底降解。为了探究白蚁肠道微生物如何帮助白蚁消化食物，本研究以培菌白蚁—黄翅大白蚁为研究材料，对其肠道微生物进行研究。
　　首先，采用高通量测序的方法，比较分析了黄翅大白蚁前肠、中肠和后肠共生微生物（细菌、真菌和古菌）的多样性。分析结果发现，白蚁前肠和中肠的优势细菌菌门为Proteobacteria（变形菌门），后肠的优势细菌菌门为Bacteroidetes（拟杆菌菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）和Proteobacteria（变形菌门）;白蚁肠道的优势真菌菌门为Ascomycota（子囊菌门）;白蚁肠道的古菌85％为未知古菌，鉴定到的古菌大多数与甲烷的产生有关。Alpha多样数指数表明，后肠细菌多样性高于中肠和前肠;中肠真菌多样性高于后肠和前肠;前肠古菌多样性高于中肠和后肠。黄翅大白蚁不同肠道区域的肠微生物菌群结构存在明显的差异。
　　然后，利用传统的分离纯化方法，以几丁质为唯一碳源的培养基分离培养能够降解几丁质的后肠微生物。根据胶体几丁质水解圈的大小筛选可以降解几丁质的微生物。然后通过形态学、生理生化以及16S rRNA基因序列分析进行菌株鉴定。从黄翅大白蚁后肠中筛选到8株能够降解胶体几丁质的细菌，它们分别属于Flavobacterium（黄杆菌属）、Dactylosporangium（指孢囊菌属）、Brevibacillus（短芽孢杆菌属）、Sphingomonas（鞘氨醇单胞菌属）、Paenibacillus（类芽孢杆菌属）、Cellulomonas（纤维单胞菌属）、Stenotrophomonas（寡养单胞菌属）、Bacillus（芽孢杆菌属）。纯化的8株菌，均具有几丁质、EG和BG酶活。这一研究为了解白蚁肠道微生物协助白蚁消化食物机制提供了依据。
　　最后，将第二部分得到的新菌Cellulomonas macrotermitis进行分类鉴定。
　　本文以培菌白蚁黄翅大白蚁为研究材料，比较分析了黄翅大白蚁前肠、中肠和后肠微生物菌群结构的差异;从后肠中分离培养了8株能够降解几丁质的细菌，为肠道微生物协助白蚁降解食物提供了依据;对新菌Cellulomonasmacrotermitis进行了鉴定。通过上述研究表明，黄翅大白蚁肠道中存在许多的共生微生物，这些微生物在参与白蚁的碳代谢、氮代谢以及抵御病原体的侵染方面均具有潜在的作用，但具体作用还需进一步研究。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 绪论

1．1 白蚁研究概况

1．1．1 白蚁的种类

1．1．2 白蚁肠道结构组成

1．1．3 大白蚁亚科的研究

1．2 白蚁肠道微生物

1．2．1 低等白蚁肠道微生物

1．2．2 高等白蚁肠道微生物

1．3 白蚁肠道微生物的作用

1．3．1 肠道微生物参与白蚁碳源的代谢

1．3．2 肠道微生物参与白蚁氮源的代谢

1．3．3 协助白蚁抵御病原菌的入侵

1．4 肠道微生物的研究方法

1．4．1 传统分离鉴定方法研究白蚁肠道微生物

1．4．2 分子鉴定方法研究白蚁肠道微生物

1．5 本文的立题依据和研究内容

1．5．1 立题依据

1．5．2 研究内容

第二章 黄翅大白蚁前、中、后肠微生物菌群结构比较分析

2．1 引言

2．2 实验材料、仪器与试剂

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验仪器

2．2．3 实验试剂

2．3 实验方法

2．3．1 黄翅大白蚁前、中、后肠组织的获得

2．3．2 各组织基因组DNA的提取和PCR扩增

2．3．3 数据处理和分析

2．4 实验结果

2．4．1 黄翅大白蚁的采集和解剖

2．4．2 数据处理和分析

2．4．3 Alpha多样性分析

2．4．4 白蚁肠道微生物OTU稀释曲线分析

2．4．5 白蚁肠道微生物菌群结构分析

2．5 小结与讨论

第三章 黄翅大白蚁后肠降解几丁质微生物的分离与鉴定

3．1 引言

3．2 实验材料、仪器与试剂

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验仪器

3．2．3 实验试剂

3．2．4 培养基配方

3．3．2 几丁质降解微生物的分离与纯化

3．3．3 形态学和生理生化分析

3．3．4 16S rRNA基因序列分析和系统进化树分析

3．3．5 纤维素酶活的鉴定

3．4 实验结果

3．4．1 后肠几丁质降解微生物的分离纯化

3．4．2 形态学观察和生理生化分析

3．4．3 16S rDNA序列分析

3．4．4 纤维素酶酶活的鉴定

3．5 小结与讨论

第四章 Cellulomonas macrotermitis新茵的分类鉴定

4．1 引言

4．2 实验材料、试剂与仪器

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验试剂

4．2．3 培养基的选择

4．3 实验方法

4．3．1 形态学观察和生理生化分析

4．3．2 化学成分分析

4．4 实验结果

4．4．1 形态学分析

4．4．2 生理生化分析

4．3．3 化学成分分析

4．4．4 遗传学分析

4．5 小结与讨论

第五章 总结与展望

附录

参考文献

致谢

攻读学位期间参与发表的论文