构建AraBAD工具实现蓝细菌基因表达的可靠调控及光合混养的研究

摘要

蓝细菌能够直接捕集CO2和太阳能进行生物转化，利用蓝细菌进行生物能源的合成能够减少CO2的排放并缓解全球变暖问题，因此基于蓝细菌的生物能源合成平台，成为了人们关注的焦点。蓝细菌工程菌Synechococcus elongatus是目前主要使用的模式微生物。但是，在S.elongatus中，其基因调控系统尤其是可靠的诱导性启动子模块较匮乏。同时，作为专性光合自养型微生物，S.elongatus的生物质积累严格依赖于光照，其工作效率较低，不能够在夜间工作。探索S.elongatus在自然光照条件包括昼夜循环来最大化产出能够充分利用资源来提高其竞争力。为了使S.elongatus成为一个理想的生物能源合成平台，来自于Escherichia coli的诱导性启动子PTrc启动子已经在S.elongatus中使用，但是诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷昂贵并具有一定毒性。同时，为了提高S.elongatus的工作效率，有研究通过添加有机碳源实现S.elongatus的光合混养。
　　阿拉伯糖是理想的外源有机碳源，其易于获得并且能具有经济和环境效益。因此，本研究主要在S.elongatus中构建了依赖于阿拉伯糖的AraBAD工具，包含以阿拉伯糖为诱导剂的PBAD启动子和阿拉伯糖代谢模块，并实现了基因表达的可靠调控以及光合混养。主要内容如下:
　　(1)研究首次在S.elongatus中引入了来自于E.coli的PBAD启动子，通过对比PBAD和PTrc启动子，证明了PBAD启动子的相对优势。PBAD启动子在S.elongatus中能够实现基因的无泄漏表达，且能够线性调控下游基因，并实现基因的均一性表达。而PTrc启动子的泄露较明显，线性调控和基因表达的均一性较差。除此之外，高浓度的阿拉伯糖对细胞形态无显著影响，而高浓度的IPTG会使细胞拉长。因此，PBAD启动子可作为S.elongatus理想的诱导表达模块。
　　(2)阿拉伯糖会抑制S.elongatus的生长并造成代谢压力。为了克服代谢压力并实现光合混养，研究首次以阿拉伯糖作为有机碳源实现了S.elongatus的昼夜生长。为了优化选择阿拉伯糖代谢的关键外源基因，首先探索了S.elongatus的阿拉伯糖转运能力，发现S.elongatus自身具有较强的阿拉伯糖转运能力。因此，研究通过引入来自于E.coli阿拉伯糖代谢基因araBAD实现了阿拉伯糖代谢进入戊糖磷酸途径实现光合混养。
　　(3)研究在S.elongatus中构建了AraBAD工具，包含PBAD诱导表达模块和阿拉伯糖代谢模块。通过动力学研究，表明AraBAD工具能够同时实现S.elongatus基因表达的调控和光合混养。无论在持续光照还是昼夜条件下，PBAD启动子均能够可靠调控基因表达。因此，通过唯一的添加物阿拉伯糖，AraBAD工具能够为自养型生物能源合成平台提供代谢和调控双赢的策略。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1．1 生物能源

1．1．2 化能异养型微生物合成生物能源

1．1．3 蓝细菌工程菌合成生物能源

1．2 蓝细菌的碳代谢

1．2．1 蓝细菌的兼性光合异养与专性光合自养

1．2．2 代谢工程实现蓝细菌的光合混养

1．2．3 光合混养实现高效生产生物能源

1．3 蓝细菌工程菌的诱导表达体系

1．3．1 内源性启动子

1．3．2 外源性启动子

1．3．3 利用荧光蛋白表征启动子强度

1．4 研究的目的和意义

1．4．1 目的和意义

1．4．2 主要内容

1．4．3 主要创新点

第二章 PBAD与PTrc启动子在蓝细菌工程菌中的特性表征

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验试剂与仪器

2．2．2 菌株与培养

2．2．3 质粒构建

2．2．4 转化实验

2．2．5 荧光强度测定

2．2．6 荧光显微技术

2．2．7 统计分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 荧光蛋白在大肠杆菌中的表达

2．3．2 蓝细菌工程菌的同源重组设计

2．3．3 荧光蛋白在蓝细菌工程菌中的表达

2．3．4 激光共聚焦扫描显微镜观察荧光蛋白的表达

2．3．5 高浓度诱导剂对蓝细菌形态的影响

2．4 本章小结

第三章 引入外源阿拉伯糖代谢途径实现蓝细菌光合混养的研究

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验试剂与仪器

3．2．2 菌株与培养

3．2．3 质粒构建

3．2．4 叶绿素含量测定

3．2．5 统计分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 阿拉伯糖对蓝细菌生长的影响

3．3．2 探索蓝细菌的阿拉伯糖转运能力

3．3．3 引入阿拉伯糖代谢途径缓解代谢压力并实现光合混养

3．4 本章小结

第四章 AraBAD工具在蓝细菌工程菌中的动力学研究

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验试剂和仪器

4．2．2 转化实验

4．2．3 阿拉伯糖的测定

4．3 结果与讨论

4．3．1 AraBAD工具模块设计

4．3．2 AraBAD工具在持续光照和昼夜条件下的动力学研究

4．3．3 纯光照与昼夜条件下的单位荧光强度对比

4．4 本章小结

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

致谢

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