文登盐场嗜盐菌菌种资源采集、多样性分析及四个新物种的鉴定

摘要

盐场作为一个特殊的生境，蕴含着丰富的微生物资源。生物信息学和高通量测序技术为我们研究盐场环境中的微生物群落结构多样性提供了便利。本研究以文登盐场多梯度太阳能盐田作为研究模型，结合可培养和免培养手段来探讨不同盐度下微生物的群落结构差异及环境因子对微生物群落结构的影响作用。并对于实验过程中分离到的菌株新物种，进一步进行多相分类学鉴定。
　　本研究从威海文登盐场(122°0′38.85＂E，36°57′56.49＂N)采集到10个盐度梯度分别为22.3g/L，65g/L，75g/L，85g/L，110g/L，160g/L，190g/L，235g/L，290g/L和370g/L的30个水样样品，30个泥样样品;每个盐度梯度3个平行，最终合成10个水样样品和10个泥样样品，进行实验。可培养微生物多样性分析方面:根据菌落形态及特点挑选代表性的菌株进行进一步的划线分离，纯化至含8％粗盐的改良2216E培养基，分别置于37℃和45℃的恒温培养箱中培养。最终得到可培养的菌株348株，泥样样品中变形菌门的菌株有79株，占总数47.9％;拟杆菌门的菌株有11株，占总数6.67％;放线菌门的菌株有5株，占总数3.03％;厚壁菌门的菌株有70株，占总数42.4％。泥样样品中，中等盐度菌株在四大门类中共计113株，占68.5％;高盐度菌株共计52株，占31.5％。在水样样品中，变形菌门的菌株有33株，占总数70.2％;拟杆菌门的菌株有5株，占总数10.6％;放线菌门的菌株有3株，占总数6.4％;厚壁菌门的菌株有6株，占总数12.8％。水样样品中，中等盐度菌株在四大门类中共计32株，占68.1％;高盐度菌株共计15株，占31.9％。泥样样品中潜在新菌数有41株，水样样品中潜在新菌数有23株。
　　基于免培养手段分析微生物群落结构:用古生菌特异引物519F和915R对样品进行扩增，水样和沉积物中的古生菌均被扩增。结果显示，古生菌占据了所有测出序列中的很大比例。古生菌在高盐度样品中被检测到的比例数很高。最后共得到512个属，289个科，185个目，123个纲，61个门。其中，17个最丰富的门，组成群落中的95.1％。用细菌特异引物341F和806R对样品进行微生物群落丰度的分析。发现所有文库中序列经整理后得到851个属，466个科，270个目，170个纲和72个门。在丰度最高的123个门中，组成了群落中的90.8％，成为最主要的门类。
　　CCA分析展示盐度是最重要的环境因子能调节不同盐度梯度盐池中的原核生物群落结构的变化，本实验不同盐度梯度的盐池，盐度梯度变化范围为30到370g/L。除了盐度之外，pH和溶解氧浓度也与原核群落结构有显著的相关性。
　　筛选出的潜在新物种，我们挑选了4株进行进一步的多相分类学研究。F2T是一株异养的革兰氏阴性菌，分离自威海沿海的海洋沉积物中。Q-8是唯一的呼吸醌型，主要的脂肪酸类型为iso-C15∶0。基因组DNA G+C的含量为48.7mol％。基于多相分类学鉴定结果，我们将F2T定义为Marinicella属的一个新物种，命名为Marinicella sediminis F2T(=KCTC42953T=MCCC1H00149T)。
　　WDS1C4T和WDS4C29T这两株菌均属于革兰氏阴性菌，中度嗜盐的好氧菌，分离自威海文登盐场。Q-10是这两株菌株的唯一呼吸醌型。这两株菌的主要脂肪酸为C18∶1ω7c。菌株WDS1C4T和WDS4C29T的基因组DNA G+C的含量分别为67.2和62.8mol％。通过表型特征及系统发育分析，我们可以判断菌株WDS1C4T和WDS4C29T为一个新属，两个新种。分别命名为Salibaculum Halophilum gen.nov.，sp.nov.(模式菌株WDS1C4T=MCCC1H00179T=KCTC52542T)和Salibaculum griseoflavus sp.nov.(模式菌株WDS4C29T=MCCC1H00175T=KCTC52541T)。
　　WFHF3C12T为好氧的革兰氏阴性菌株，中度嗜盐菌。最适的生长条件为37℃，pH7.5-8.0且培养基中添加10.0％(w/v)NaCl。Q8是菌株的唯一呼吸醌型。最主要的脂肪酸为C18∶1ω7c。基因组DNA G+C的含量为66.2mol％。基于表型特征及系统发育分析，我们认为该菌为外硫红螺旋菌科的一个新属，命名为Bradysalinae rhodinum gen.nov.，sp.nov.(模式菌株WFHF3C12T=KCTC52546T=MCCC1H00180T)。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 绪论

1．1 盐场微生物研究概况

1．2 多梯度太阳能盐池介绍

1．3 盐度与微生物群落结构的关系

1．4 立项依据

第二章 文登盐场嗜盐菌菌种资源采集及多样性分析

2．1 实验材料

2．1．1 样品

2．1．2 培养基与溶液

2．2．1 样品处理

2．2．2 样品稀释涂布与培养

2．2．3 菌落的统计与分离纯化

2．2．4 基于16S rRNA基因的菌株鉴定

2．3 实验结果与分析

2．3．1 本实验样品概况

2．3．2 理化因子测序结果

2．3．3 菌落计数与表型特征挑选

2．3．4 16S rDNA序列Blast比对结果

第三章 基于16S rDNA高通量测序分析的文登盐场细菌和古生菌多样性分析

3．1．2 基因组DNA抽提

3．1．3 PCR扩增

3．1．4 序列分析

3．2 生物信息分析流程

3．2．1 OTU聚类和物种注释

3．2．2 样本多样性分析

3．2．3 稀释性曲线

3．3 物种组成分析

3．3．1 群落结构组分图

3．3．2 群落Heatmap图

3．4 组间(样本间)比较分析(β多样性分析)

3．4．1 维恩图

3．4．2 PCoA分析

3．4．3 多样本相似度树状图

3．4．4 CCA模型分析

3．5 本章小结

第四章 4个新物种的多相分类学研究

4．1 实验材料

4．1．1 实验菌株

4．1．2 培养基

4．1．3 主要实验试剂

4．1．4 主要实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 菌株表型特征与保藏

4．2．2 菌株生理生化特性的测定

4．2．3 菌株遗传学特征的分析鉴定

4．2．4 菌株化学特征的分析鉴定

4．3 实验结果与分析

4．3．1 沉积物海杆菌(M．sediminis)F2T的多相分类鉴定

4．3．2 嗜盐盐杆菌(Salibaculum Halophilum)WDS1C4T和灰黄盐杆菌(Salibaculum griseoflavus)WDS4C29T的多相分类鉴定

4．3．3 浅红慢生盐场菌(Bradysalinae rhodinum)WFHF3C12T的多相分类鉴定

4．4 本章小结

全文总结与展望

参考文献

致谢

资助情况

攻读硕士学位期间发表的学术论文