海洋链霉菌辅酶依赖型氧化还原酶(CHIE4)的体外重组表达及功能初步研究

摘要

高盐、高压、低温、低氧和寡营养等极端环境造就了海洋链霉菌独特的代谢方式，使其次级代谢产物丰富多样进而成为新型活性物质的重要来源。分离自青岛胶州湾的海洋链霉菌（Streptomyces griseoaurantiacus）菌株M045能够产生手霉素A、中尼霉素A和B等多种抗生素。其中，中尼霉素A是由前体物质手霉素A经辅酶依赖型氧化还原酶CHIE4催化合成。研究表明中尼霉素可抑制黑色素瘤与乳腺癌的发生，并对农作物病原真菌具有抑制活性，因而具有较高的研究与应用价值。
　　本课题采用多种蛋白表达系统对来自海洋链霉菌菌株M045的CHIE4进行了体外重组表达研究。结果表明，由原核表达载体pET28表达的CHIE4会形成包涵体，通过透析和复性等处理能够获得可溶性的CHIE4，但是活性检测发现该CHIE4的催化活性基本丧失。利用原核表达载体pMAL-p5x和pMAL-c5x可获得与麦芽糖结合蛋白标签融合表达的可溶性CHIE4。该融合蛋白经MBP亲和层析、TEV蛋白酶酶切和Ni柱串联亲和层析可得到纯化的单一CHIE4，活性检测实验证实该CHIE4具备催化活性。实验同时证实利用真核表达载体pPIC9K和毕赤酵母表达系统无法获得CHIE4的表达。
　　辅酶依赖型氧化还原酶CHIE4的编码基因GC含量高达65%，原核表达易形成包涵体，变性复性后蛋白又极易失去催化活性，为CHIE4的生产应用带来挑战。本研究利用麦芽糖结合蛋白标签融合表达系统，经蛋白酶切和串联亲和层析获得了具有催化活性的CHIE4，为实现CHIE4的大规模应用和中尼霉素的工业化生产奠定基础。

目录

引言

1 实验材料

1.1 实验菌株及载体

1.2 主要实验试剂

2. 实验方法

2.1 重组表达载体的构建

2.2 目的蛋白的表达纯化

2.3 重组蛋白的活性检测实验

3. 实验结果与分析

3.1 原核重组表达载体构建结果

3.2 真核重组载体构建

3.3 原核表达载体的重组表达

3.4 真核表达载体的重组表达

4 重组蛋白的酶活实验

4.1 纯化后重组目的蛋白浓度定量

4.2 标准曲线的绘制

4.3 紫外可见光吸收光谱

4.4 辅酶FAD的紫外吸收光谱变化曲线

4.5 辅酶FMN的紫外吸收光谱变化曲线

4.6 辅酶FAD和FMN的时间梯度的吸光值变化

5. 讨论

6. 结论

参考文献

综述

1. 海洋链霉菌概述

2. 关于海洋链霉菌次级代谢产物的最新研究内容

3. 手霉素类化合物

4. 链霉菌M-045概述

5. 氧化还原酶研究进展

6. 小结与展望

综述参考文献

攻读学位期间研究成果

致谢

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