裂殖壶菌CRISPR/Cas9体系的建立及应用于脂肪酸代谢研究

摘要

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid,DHA）是一种极为重要的n-3多不饱和脂肪酸，具有抗癌、抗炎、预防心血管疾病的作用，并能促进婴幼儿神经系统和视觉系统的发育和成熟。而裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)是属于破囊壶菌科的一类海洋真菌，体内积累了大量的DHA，是目前已知的DHA含量最高的海洋真菌，因其具有的重要经济价值而备受人们关注。因此通过对裂殖壶菌DHA合成途径的研究，利用生物工程方法来最大限度提高裂殖壶菌DHA产量，具有极为重要的生物学意义和经济价值。
　　CRISPR/Cas9是一种高效准确的新兴基因编辑技术，目前已应用该技术成功在多个物种实现基因编辑。本文旨在以裂殖壶菌为研究对象，通过构建相应的CRISPR/Cas9基因编辑系统，对裂殖壶菌中与脂肪酸合成相关的基因进行敲除，并替换为Zeocin抗性基因片段，初步探索CRISPR/Cas9基因编辑系统在海洋真菌裂殖壶菌中的应用，以及相关基因敲除后对脂肪酸产量的影响。据此，本实验的主要内容及研究结果如下：
　　（1）为了确定本实验的选择标记基因，从而能够成功筛选出转化菌株，本实验选取了基因工程中常用的抗生素Zeocin、氨苄青霉素（Amp）和卡那霉素（Kan），分别研究其对裂殖壶菌生长的影响，结果表明，浓度为50μg/mL和100μg/mL的氨苄青霉素和卡那霉素对裂殖壶菌的生长基本没有影响，而Zeocin抗生素浓度为50μg/mL时，裂殖壶菌的生长受到一定的抑制作用，当Zeocin浓度为100μg/mL时，裂殖壶菌的生长被完全抑制，且到第十天仍没有菌落出现，所以本研究选择Zeocin作为裂殖壶菌的抗性筛选试剂，筛选浓度浓度为100μg/mL。
　　（2）根据专门的设计网站https://www.dna20.com/products/crispr设计出用于敲除裂殖壶菌PKS亚基PksD基因的gRNA序列，并将该序列构建进能够高效表达CRISPR/Cas9系统的pCRISPR-Schi载体中。利用重叠延伸PCR克隆出带有PksD基因上下游区域同源序列的Zeocin抗性基因片段，通过电转化方法将该片段与CRISPR载体转入裂殖壶菌中，成功得到PksD基因敲除的裂殖壶菌菌株，且转化效率达到80%。而通过对转化菌株和野生型菌株生物量的测定可知，细胞干重并没有太大差异，说明CRISPR载体和抗性基因片段的插入对菌株的正常生长没有太大影响，也进一步说明CRISPR/Cas9基因编辑系统适用于海洋真菌裂殖壶菌，并且能够快速、高效地对裂殖壶菌进行相关基因的敲除与加入。
　　（3）对敲除PksD基因的裂殖壶菌阳性菌株，采用气相色谱-质谱（GC-MS）对其脂肪酸含量进行测定，结果发现，转化菌株与野生型菌株相比，各转化菌株总脂含量均有一定程度的提高，而脂肪酸的组成没有发生变化，但与野生型菌株相比，转化菌株的DHA含量降低约20%，说明PksD基因的破坏对总脂和DHA的合成产生了影响，进一步说明PksD基因在裂殖壶菌脂肪酸合成的PKS途径中起着比较重要的作用。该体系的构建为后续运用CRISPR/Cas9系统研究裂殖壶菌的基因功能奠定了基础。

目录

第1章 绪论

1.1 n-3多不饱和脂肪酸研究进展

1.2 裂殖壶菌研究概况

1.3 CRISPR/Cas9简述

1.4 研究内容及意义

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 抗生素的筛选

2.4 CRISPR/Cas体系的构建及转化

2.5 电转化及突变体的鉴定

2.6 生物量和油脂产量分析

第3章 结果与讨论

3.1 裂殖壶菌抗性验证

3.2 pCRISPR-Schi-gRNA质粒构建测序结果

3.3靶向区域上下游同源片段及Zeocin抗性片段的扩增

3.4 电转化结果及菌株鉴定

3.5 菌株生物量和脂肪酸分析

3.6 讨论

第4章 结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

参考文献

攻读学位期间的研究成果

致谢

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