斯氏艾美耳球虫TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

摘要

本文对斯氏艾美耳球虫TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立进行了研究。兔球虫病是由艾美耳属球虫引起的寄生性原虫病。其中斯氏艾美耳球虫致病性最强,寄生在胆管上皮细胞，能引起严重的肝球虫病。为了提高对兔斯氏艾美耳球虫感染检测的特异性和敏感性，选择虫体的COI序列，设计了斯氏艾美耳球虫的引物及TaqMan探针，并建立了斯氏艾美耳球虫实时荧光定量PCR检测方法。反应模板的浓度和CT值在107拷贝/μL到10拷贝/μL之间具有良好的线性关系，其相关系数为0.999，扩增效率为88.472％；灵敏度达10拷贝/μL；特异性强，与其他相关兔球虫没有交叉反应，且重复性良好；对接种了斯氏艾美耳球虫的家兔肝脏进行了病理学观察，可见肝肿大，表面和内部布满白色米粒大小的结节，且随着接种时间的延长，病变愈加明显，镜下可观察到球虫卵囊；同时进行实时荧光定量PCR检测，结果阳性符合率达100%。

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1 前言

1.1.1 兔球虫病流行特点

1.1.2 兔球虫种类

1.1.3 兔球虫卵囊形态特征

1.1.4 兔球虫基因组特点

1.2 斯氏艾美球虫概述

1.2.1 斯氏艾美耳球虫国内流行状况

1.2.2 斯氏艾美耳球虫卵囊形态特征

1.2.3 斯氏艾美耳球虫的发育史

1.2.4 斯氏艾美耳球虫病临床症状与病理变化

1.2.5 斯氏艾美耳球虫病诊断

1.3.1 基于核基因组的鉴定技术

1.3.2 基于线粒体基因组的鉴定技术

1.3.3 基于顶质体基因组的鉴定技术

1.3.4 不同鉴定技术的特点

1.4 实时荧光定量PCR原理

1.4.1 RT-PCR的定量原理

1.4.2 Ct值与荧光域值

1.4.3 TaqMan探针检测方法

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 虫种来源

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器设备

2.2 方法

2.2.1 引物设计

2.2.2 艾美耳球虫卵囊DNA提取

2.2.3 艾美耳球虫COI序列PCR扩增与测序

2.2.4 兔艾美耳球虫COI序列分析比对

2.2.5 兔艾美耳球虫TaqMan荧光探针及引物设计

2.2.6 重组参比质粒构建

2.2.7 艾美耳球虫TaqMan探针实时荧光定量PCR检测体系建立

2.2.8 特异性试验

2.2.9 敏感性试验

2.2.10 标准曲线制作

2.2.11 重复性试验

2.2.12 动物试验

3 结果

3.1 COI序列扩增结果

3.2 特异性检测结果

3.3 敏感性检测结果

3.4 标准曲线制作结果

3.5 重复性检测结果

3.6 动物样本检测结果

3.7 被检动物临床症状及肝脏病理变化

4 讨论

5 结论

致谢

参考文献

作 者 简 介