绒山羊CRISP1与PDIA3相互作用以及CRISP1在睾丸和顶体反应前后的精子中定位的探讨

摘要

哺乳动物受精是精子和卵子相互结合、融合形成合子的过程。它既是胚胎发育的开始，也是一个新生命的起点。但是，人们对受精的分子机制却知之甚少。综合该方向的研究成果和本实验室的研究结果，我们猜测在精卵融合过程中，富含半胱氨酸的CRISP1可能与二硫异构酶PDIA3之间存在相互作用。因此本实验解析这两种蛋白之间的相互作用以及CRISP1在睾丸和顶体反应前后精子中的定位。
　　本实验选用pET-32a作为原核表达载体，构建了原核表达载体pET-CRISP1。将pET-CRISP1转化进大肠杆菌中利用IPTG进行诱导表达，成功得到了融合蛋白HIS-CRISP1。利用切胶纯化的方法分离纯化融合蛋白HIS-CRISP1，经纯化的HIS-CRISP免疫昆明(KM)小鼠，成功制备了小鼠抗绒山羊CRISP1腹水多克隆抗体。用自制小鼠抗绒山羊CRISP1腹水多克隆抗体分别处理绒山羊睾丸组织切片和精子涂片，免疫组织化学和免疫细胞化学检测结果显示，CRISP1广泛存在于绒山羊睾丸组织中;在未发生顶体反应的绒山羊精子中，CRISP1主要存在于精子尾部;在发生了顶体反应的绒山羊精子中，CRISP1主要存在于精子的赤道区。
　　本实验构建了酵母表达载体pGAD-CRISP1、pGAD-CRISP1(A)、pGAD-CRISP1(B)和pGBK-PDIA3，本实验室保存有酵母表达载体pGBK-PDIA3(A)和pGBK-PDIA3(B)，将上述酵母表达载体两两组合进行酵母双杂交实验，结果显示，绒山羊CRISP1与PDIA3之间存在相互作用，且PDIA3(A)段与CRISP1发生了相互作用。同时，本实验构建了带有HIS标签的pcDNA-CRISP1和带有HA标签的pcDNA-PDIA3真核表达载体，将两种真核表达载体共转染至293T细胞中，利用免疫共沉淀技术western blotting结果显示，绒山羊CRISP1与PDIA3之间存在相互作用。
　　此外，本实验还筛选出了绒山羊CRISP1单克隆稳定细胞系，以便稳定表达绒山羊CRISP1蛋白。

目录

声明

符号说明

摘要

第一章 绒山羊CRISP1的融合蛋白原核表达及融合蛋白的分离纯化

一、材料和方法

1．1 材料

1．2 实验方法

二、结果

2．1 CRISP1全长测序结果分析

2．2 重组克隆T载体的构建与pET32a-CRISP1重组载体酶切及测序鉴定

2．3 pET32a-CRISP1在大肠杆菌中的诱导表达与His-CRISP1融合蛋白的Western-blot鉴定

2．4 融合蛋白的包涵体分析

2．5 融合蛋白的分离纯化结果

三、讨论

第二章 绒山羊CRISP1腹水多克隆抗体制备及纯化

一、材料和方法

1．1 材料

1．2 实验方法

二、结果

2．1 多克隆抗体的鉴定与特异性分析

2．2 抗体的效价测定

三、讨论

第三章 CRISP1蛋白在山羊睾丸组织和精子中的定位检测

一、材料和方法

1．1 材料

1．2 实验方法

二、结果

2．1 绒山羊睾丸组织中CRISP1的定位

2．2 精子细胞顶体反应前后不同形态的免疫化学定位

三、讨论

第四章 绒山羊CRISP1与PDIA3蛋白相互作用研究

一、材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

二、结果

2．1 CRISP1与PDIA3的氨基酸序列与结构域分析

2．2 酵母表达载体的构建

2．3 酵母阳性菌落PCR鉴定

2．4 酵母杂交形成三聚体

2．5 酵母四缺板

2．6 真核表达载体构建

2．7 免疫共沉淀及western结果

2．8 原核表达载体PGEX-PDIA3构建

2．9 GST pull-down结果

三、讨论

第五章 绒山羊CRISP1与PDIA3蛋白的真核单克隆稳定细胞系的建立

一 材料和方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

二、结果

2．1 构建红色荧光真核表达载体

2．2 单克隆稳定细胞筛选

三、讨论

精子膜蛋白CRISP1的功能和在受精过程中的分子机制

致谢

读硕士期间参与的科研项目和发表的学术论文