编码10×Aβ3-10的基因重组腺病毒载体疫苗免疫治疗阿尔茨海默病APPswe/PSEN1dE9双转基因鼠的效果及副作用研究

摘要

目的：
　　 阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)是一种年龄相关的神经系统变性疾病,是引起老年期痴呆的最常见原因。主要病理特征为老年斑(senileplaques,SP)和神经原纤维缠结(neurofibrllarytangles,NFT)。老年斑由死亡和破坏的神经元围绕致密的β淀粉样蛋白(amyloid-beta,Aβ)核心组成。目前AD的治疗不能预防和逆转疾病,只能改善症状。普遍认为有神经毒性的Aβ聚集是AD发生和进展的始动因素。所以AD的治疗研究主要集中在减少脑内Aβ沉积和阻断病理形式Aβ形成。
　　 用Aβ1-42肽多次免疫转基因AD模型鼠可以预防淀粉样斑块形成并使已形成的淀粉样沉积明显减少,并可以使转基因鼠学习和记忆能力提高。虽然动物实验获得成功,但Aβ1-42疫苗(AN1792)临床试验由于Ⅱa期临床试验6%的病人出现了中枢神经系统炎症而被迫停止。虽然这种副作用确切原因不清楚,但是推测与Aβ的T细胞抗原决定簇特异性的T细胞反应或传统佐剂QS21有关。
　　 针对Aβ的免疫治疗是治疗和预防AD的有效方法,但传统主动免疫可能引起脑炎等副作用,而且多次应用Aβ全肽段可能出现其在脑内沉积及引起脑细胞毒性的危险。我们拟构建编码10次重复AβN末端片段Aβ3-10和CpG序列的基因重组腺病毒载体疫苗Ad-10×Aβ3-10-CpG,鼻粘膜免疫BALB/c鼠和APPswe/PSEN1dE9双转基因鼠,通过血清抗体检测,行为学检测,细胞因子检测、体外脾细胞增殖反应,脑内Aβ斑块沉积检测,脑内星型胶质细胞检测,脑内淋巴细胞浸润检测,脑组织HE及普鲁士蓝染色,评价基因重组腺病毒载体疫苗Ad-10×Aβ3-10-CpG治疗阿尔茨海默病APPswe/PSEN1双转基因鼠的效果和副作用。
　　 方法：
　　 一、用基因重组腺病毒疫苗鼻粘膜免疫BALB/c鼠,疫苗免疫原性检测
　　 (一)基因重组腺病毒载体疫苗Ad-10×Aβ3-10-CpG测序验证
　　 (二)ELISA法检测血清抗Aβ抗体滴度及亚型
　　 (三)抗体功能测定:免疫组化方法检测免疫后的BALB/c小鼠抗血清能否与双转基因鼠脑内Aβ斑块结合。
　　 (四)免疫组化法检测鼻粘膜内Aβ蛋白的表达
　　 二、用基因重组腺病毒疫苗鼻粘膜免疫APPswe/PSEN1dE9双转基因鼠,治疗效果评价
　　 (一)ELISA法检测血清抗Aβ抗体滴度及亚型
　　 (二)抗体功能测定:用免疫组化方法检测免疫后的双转基因鼠抗血清能否与双转基因鼠脑内Aβ斑块结合。
　　 (三)Ad-10×Aβ3-10-CpG免疫APPswe/PSEN1dE9双转基因鼠,治疗效果评价
　　 1、Morris水迷宫行为学检测
　　 2、免疫组化检测APPswe/PSEN1dE9双转基因鼠脑内淀粉样斑块
　　 3、ELISA法检测APPswe/PSEN1dE9双转基因鼠脑组织匀浆和血清中可溶性Aβ水平
　　 三、用基因重组腺病毒疫苗鼻粘膜免疫APPswe/PSEN1dE9双转基因鼠,炎症反应及其他副作用检测
　　 (一)脾细胞培养及增殖反应
　　 (二)脑组织星型胶质细胞反应检测:免疫组化法检测星形胶质细胞及Aβ和GFAP双染
　　 (三)脑组织淋巴细胞浸润检测:免疫组化法检测CD3,CD5和CD45阳性细胞
　　 (四)细胞因子测定:ELISA法检测脾细胞培养上清和脑组织匀浆中IL-4和INF-γ
　　 (五)脑组织微出血检测:普鲁士蓝染色
　　 (六)肝、肾、心、脾、肺组织形态观察:HE染色
　　 结果：
　　 一、用基因重组腺病毒疫苗鼻粘膜免疫BALB/c鼠
　　 (一)疫苗测序鉴定
　　 编码10次重复Aβ3-10基因片段,CpG序列,Cozak序列及相关酶切位点已成功连接到载体pLP-Aden0-X-CW上,克隆序列正确。
　　 (二)血清抗Aβ抗体滴度及类型
　　 各组免疫前的血清未检测到抗Aβ抗体,第2次免疫后,Ad-10×(Aβ3-10)-CpG组和Aβ1-42组抗体水平随着免疫次数逐渐增加,而空腺病毒载体组抗体水平一直呈基线水平。Ad-10×(Aβ3-10)-CpG疫苗产生的抗Aβ抗体主要为IgG1,主要产生Th2型免疫应答。
　　 (三)抗体功能
　　 Ad-10×(Aβ3-10)-CpG组和Aβ1-42组小鼠的抗血清能和转基因鼠脑内的Aβ斑块结合,而免疫前的血清和空腺病毒载体组的血清不能与转基因鼠脑内的Aβ斑块结合。
　　 (四)鼻粘膜内Aβ蛋白表达
　　 Ad-10×(Aβ3-10)-CpG组鼻粘膜内可以检测到Aβ蛋白表达,而其他各组小鼠鼻粘膜内未检测到Aβ蛋白表达。
　　 二、基因重组腺病毒疫苗鼻粘膜免疫APPswe/PSEN1dE9双转基因鼠改善其学习记忆功能,促进其脑内Aβ斑块清除
　　 (一)血清抗Aβ抗体滴度及类型
　　 各组免疫前的血清未检测到抗Aβ抗体,第2次免疫后,Ad-10×(Aβ3-10)-CpG组和Aβ1-42组抗体水平随着免疫次数逐渐增加,而空腺病毒载体组抗体水平一直呈基线水平。Ad-10×(Aβ3-10)-CpG疫苗产生的抗Aβ抗体主要为IgG1,主要产生Th2型免疫应答。
　　 (二)抗体功能
　　 Ad-10×(Aβ3-10)-CpG组和Aβ1-42组小鼠的抗血清都能和转基因鼠脑内的Aβ斑块结合,而免疫前的血清和空腺病毒载体组的血清不能与转基因鼠脑内的Aβ斑块结合。
　　 (三)Ad-10×(Aβ3-10)-CpG鼻粘膜免疫可以改善APPswe/PSEN1dE9双转基因学习记忆功能,促进脑内Aβ斑块清除
　　 1、Morris水迷宫行为学实验
　　 可视平台实验:Aβ1-42组,Ad-10×(Aβ3-10)-CpG组和空腺病毒载体组平均逃避潜伏期无明显差异(P＞0.05)。
　　 隐藏平台获得实验:Aβ1-42组,Ad-10×(Aβ3-10)-CpG组和空腺病毒载体组小鼠逃避潜伏期都随训练次数增加而缩短。Aβ1-42组和Ad-10×(Aβ3-10)-CpG组的逃避潜伏期明显小于空腺病毒载体组,而Aβ1-42组和Ad-10×(Aβ3-10)-CpG组的平均逃避潜伏期无明显差异(P＞0.05)。
　　 空间探索实验:Aβ1-42组和Ad-10×(Aβ3-10)-CpG组在靶象限的停留时间明显长于空腺病毒载体组(P＜0.01),而Aβ1-42组和Ad-10×(Aβ3-10)-CpG组在靶象限的停留时间无明显差异(P＞0.05)。Aβ1-42组和Ad-10×(Aβ3-10)-CpG组穿越平台所在位置的次数明显多于空腺病毒载体组(P＜0.05),而Aβ1-42组和Ad-10×(Aβ3-10)-CpG组穿越平台所在位置次数无明显差异(P＞0.05)。游泳距离、平均游泳速度各组间比较无差异(P＞0.05)。训练早期及空腺病毒载体组的游泳轨迹主要以游泳池边缘型为主,Aβ1-42组和Ad-10×(Aβ3-10)-CpG组的游泳轨迹随着训练次数的增多趋向以围绕平台周围的搜索轨迹为主。
　　 2、免疫后各组双转基因鼠脑内淀粉样斑块改变
　　 Aβ1-42组和Ad-10×(Aβ3-10)-CpG组免疫治疗后脑组织Aβ斑块沉积所占面积百分比与空腺病毒载体组比较明显减少(P＜0.01)。
　　 3、各组转基因鼠脑组织匀浆和血清中可溶性Aβ水平
　　 Aβ1-42组和Ad-10×(Aβ3-10)-CpG组脑组织匀浆和血清中可溶性Aβ42水平明显高于空腺病毒载体组(P＜0.01),而Aβ1-42组和Ad-10×(Aβ3-10)-CpG组无明显差异(P＞0.05)。
　　 三、基因重组腺病毒疫苗鼻粘膜免疫APPswe/PSEN1dE9双转基因鼠,不引起炎症反应及其他副作用
　　 (一)脾细胞培养及增殖反应在Aβ1-42组及Ad-10×(Aβ3-10)-CpG组,其相对应的免疫原刺激孔产生较高水平的增殖率,高于非相应免疫原刺激孔(P＜0.05),但低于ConA刺激孔的增殖率(P＜0.05)。
　　 (二)Ad-10×Aβ3-10-CpG鼻粘膜免疫减少星形胶质细胞激活
　　 皮层和海马区GFAP阳性细胞所占百分比为:空腺病毒载体组＞Aβ1-42组＞Ad-10×(Aβ3-10)-CpG组。活化的星形胶质细胞分布在Aβ斑块周围和内部。
　　 (三)脑组织淋巴细胞浸润
　　 免疫组化法检测到各小鼠脑组织在血管内,脑实质偶尔发现个别CD3,CD5和CD45阳性细胞,三组没有显著差异。
　　 (四)脾细胞培养上清和脑组织匀浆IL-4,INF-γ
　　 Aβ1-42组和Ad-10×(Aβ3-10)-CpG组中在其相对应的免疫原刺激时检测到较高水平的IL-4、IFN-γ。Aβ1-42组在Aβ1-42肽刺激孔的IFN-γ水平显著高于Ad-10×(Aβ3-10)-CpG组在Aβ3-10肽刺激孔的IFN-γ水平(P＜0.05)。脑组织匀浆中IL-4水平Ad-10×(Aβ3-10)-CpG组,Aβ1-42组和空腺病毒载体组没有明显差异(P＞0.05),脑组织匀浆中IFN-γ水平,Aβ1-42组和Ad-10×(Aβ3-10)-CpG组高于空腺病毒载体组(P＜0.05),Aβ1-42组高于Ad-10×(Aβ3-10)-CpG组(P＜0.05)。
　　 (五)各组未发现脑组织微出血
　　 脑皮层、海马、侧脑室旁及基底节区均未见染色成蓝色的含铁血黄素。
　　 (六)肝、肾、心、脾、肺组织形态
　　 HE染色显示各组小鼠脑及其他脏器(心、肝、脾、肺、肾)组织结构正常,细胞排列有序,细胞形态清晰。脑组织皮层及海马细胞排列层次有序,海马区锥体细胞层及颗粒细胞层清晰可见。
　　 结论：
　　 腺病毒疫苗Ad-10×(Aβ3-10)-CpG鼻粘膜免疫小鼠,Aβ蛋白可以在鼻粘膜表达,血清中能产生抗Aβ抗体,引起的免疫反应以Th2型为主。
　　 腺病毒疫苗Ad-10×(Aβ3-10)-CpG鼻粘膜免疫可以改善APPswe/PSEN1dE9双转基因鼠学习和记忆功能,能够促进转基因鼠脑内Aβ清除。
　　 腺病毒疫苗Ad-10×(Aβ3-10)-CpG鼻粘膜免疫没有引起脑内炎症反应、脑组织微出血等明显副作用。
　　 腺病毒疫苗Ad-10×(Aβ3-10)CpG有Aβ1-42肽疫苗同样的治疗效果,而避免了Aβ1-42全肽段所引起的炎症反应。腺病毒疫苗Ad-10×Aβ3-10-CpG可以作为治疗AD的候选理想疫苗。