EF24提高非小细胞肺癌细胞放射敏感性和逆转放射所致上皮间质转化的机制研究

摘要

目的:放射治疗是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的重要治疗手段，然而放射治疗后仍然会有部分患者出现局部复发导致放疗失败，肿瘤细胞对放射线抵抗是导致局部复发的重要原因，提高肿瘤细胞的放射敏感性将对提高放疗疗效有重要意义。二苯基二氟酮(EF24)是一种新型人工合成药物，具有促进肿瘤细胞凋亡，导致细胞周期G2/M阻滞，抑制上皮间质转化(epithelialmesenchymal transition，EMT)等多种作用。最近研究发现EF24能通过上调肿瘤抑制蛋白(von Hippel-Lindau protein，pVHL)降低肝癌细胞中的乏氧诱导因子-1α(hypozia inducible factor-1a，HIF-1a)，因此推测EF24可能会提高肿瘤细胞放射敏感性，为评估EF24是否能提高NSCLC细胞放射敏感性并探讨其作用机制进行了如下研究。
　　研究方法:以A549和H460两种人NSCLC细胞系为研究对象，应用克隆形成实验及细胞存活曲线检测放射敏感性，应用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期，建立A549细胞放射残留EMT模型，应用Western blot法检测目的蛋白:HIF-1a、pVHL、Bax、Bcl-xl、p53、p21、E-cadherin、N-cadherin的表达情况。所有实验数据都用3次独立实验得到的均值±标准差表示。应用SPSS13.0软件进行单因素方差分析比较均值，P＜0.05时认为差异具有统计学意义。
　　结果:
　　1、EF24对A549和H460细胞放射敏感性的影响
　　克隆形成实验及细胞存活曲线结果显示A549和H460细胞系照射加EF24(IR+EF)组的D0和SF2值均较其相应单纯照射(IR)组呈现不同程度的下降。EF24对A549和H460细胞系的放射增敏比(sensitivity enhancement ratio，SER)分别为1.15和1.34。┏━━━┳━━━━━┳━━━━┳━━━━┳━━━━┓┃┃┃ D0┃ SF2┃ SER┃┣━━━╋━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━┫┃┃ IR┃2.45┃0.84┃┃┃A549┃┃┃┃┃┃┃ IR+EF┃2.13┃0.69┃1.15┃┣━━━╋━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━┫┃┃ IR┃1.61┃0.51┃┃┃H460┃┃┃┃┃┃┃ IR+EF┃1.20┃0.45┃1.34┃┗━━━┻━━━━━┻━━━━┻━━━━┻━━━━┛
　　2、EF24影响A549和H460细胞放射敏感性的机制
　　2.1、EF24对A549和H460细胞凋亡的影响
　　流式细胞术检测细胞凋亡结果显示，A549细胞系空白对照组，EF组，IR组和IR+EF组细胞凋亡比例分别为3.79±0.18％，17.09±1.69％，7.51±0.34％和24.96±1.47％。EF组与空白对照组相比凋亡比例明显增加（P＜0.01），且EF能增加射线诱导的凋亡，IR+EF组比IR组细胞凋亡比例进一步增加（P＜0.01）。同样H460细胞系空白对照组，EF组，IR组和IR+EF组细胞凋亡比例分别为3.09±0.02％，5.80±0.28％，9.17±0.23％和16.62±0.62％。EF组与空白对照组相比凋亡比例明显增加(P＜0.01)，且IR+EF组比IR组细胞凋亡比例进一步增加（P＜0.01）。
　　2.2、EF24对A549和H460细胞周期的影响
　　流式细胞术检测细胞周期结果显示，A549细胞系空白对照组，EF组，IR组和IR+EF组细胞G2/M期比例分别为17.46±1.48％，27.74±1.80％，28.44±2.12％和43.38±2.66％。EF组与空白对照组相比G2/M期比例增加了58.88％（P＜0.01），IR+EF组与IR组相比G2/M期比例增加了52.53％（P＜0.01）。同样H460细胞系空白对照组，EF组，IR组和IR+EF组细胞G2/M期比例分别为18.79±1.48％，33.24±2.35％，27.07±1.89％和45.10±3.11％。EF组与空白对照组相比G2/M期比例增加了76.90％（P＜0.01），IR+EF组与IR组相比G2/M期比例增加了66.61％（P＜0.01）。
　　2.3、EF24对A549和H460细胞照射后蛋白表达的影响
　　2.3.1、EF24对A549和H460细胞照射后HIF-1a和pVHL蛋白表达的影响
　　Western blot结果A549细胞系空白对照组，EF组，IR组和IR+EF组的HIF-1a相对表达比例分别为:1.01±0.05，0.93±0.06，1.52±0.08和0.97±0.10。IR组的HIF-1a表达明显高于空白对照组（P＜0.01），说明放射线可以激活HIF-1a。而EF24能抑制照射导致的HIF-1a升高，IR+EF组与IR组相比HIF-1a表达明显下降(P＜0.01)。H460细胞系中空白对照组，EF组，IR组和IR+EF组的HIF-1a相对表达比例分别为:1.10±0.09，1.06±0.08，2.13±0.11和0.96±0.10。IR+EF组的HIF-1a表达也较对IR组明显下降(P＜0.01)。
　　我们进一步检测了HIF-1a的负向调节因子pVHL的表达。结果发现X射线照射会抑制pVHL表达，而EF24能逆转这一作用。A549细胞系空白对照组，EF组，IR组和IR+EF组的pVHL相对表达比例分别为:1.00±0.03，1.05±0.09，0.43±0.02和1.06±0.07。IR组的pVHL表达明显低于空白对照组（P＜0.01），而IR+EF组的pVHL表达则较IR组明显升高(P＜0.01)。同样在H460细胞系空白对照组， EF组，IR组和IR+EF组的pVHI相对表达比例分别为:0.99±0.02，1.23±0.03，0.60±0.01和1.06±0.08。IR组的pVHL表达也明显低于于空白对照组（P＜0.01），而IR+EF组的pVHL表达则较IR组明显升高（P＜0.01）。
　　2.3.2、EF24对A549和H460细胞照射后凋亡相关蛋白Bax和Bcl-xl表达的影响
　　我们检测了影响细胞凋亡的两个蛋白:促进凋亡的Bax蛋白和抑制凋亡的Bcl-xl蛋白的表达情况。结果显示A549细胞系空白对照组，EF组，IR组和IR+EF组的Bax相对表达比例分别为:1.03±0.05，3.13±0.12，3.81±0.12和4.98±0.13。EF组和IR组的Bax表达都明显高于空白对照组（P＜0.01），二者联合具有协同作用，IR+EF组与EF组或IR组相比P＜0.01。在H460细胞系中空白对照组，EF组，IR组和IR+EF组的Bax相对表达比例分别为:0.99±0.03，2.14±0.09，1.79±0.06和2.23±0.19。EF组和IR组的Bax表达也都明显高于空白对照组（P＜0.01），IR+EF组的Bax表达比IR组进一步升高(P＜0.01)。EF对抗凋亡蛋白Bcl-xl的影响与凋亡蛋白Bax的正好相反，结果显示EF24能明显抑制X射线照射导致的Bcl-xl升高。A549细胞系空白对照组，EF组，IR组和IR+EF组的Bcl-xl相对表达比例分别为:1.05±0.06，0.96±0.11，4.38±0.33和1.01±0.18。IR组的Bcl-xl表达较空白对照组明显升高(P＜0.01)，而EF24能抑制照射引起的Bcl-xl表达，（IR+EF组与IR组比较，P＜0.01）。在H460细胞系中空白对照组，EF组，IR组和IR+EF组的Bcl-xl相对表达比例分别为:1.03±0.03，0.96±0.10，3.19±0.14和0.87±0.10。照射同样能使H460细胞Bcl-xl升高（IR组与空白对照组比较，P＜0.01），而IR+EF组Bcl-xl表达也较IR组明显下降（P＜0.01）。
　　2.3.3、EF24对A549和H460细胞照射后细胞周期相关蛋白p53和p21表达的影响
　　结果显示A549细胞系空白对照组，EF组，IR组和IR+EF组的p53相对表达比例分别为:0.94±0.07，2.56±0.08，3.17±0.16和3.82±0.12。A549细胞系IR组和EF组的p53表达都明显高于空白对照组(P＜0.01)，提示EF24和放射线能导致p53升高。IR+EF组的p53表达比EF组或IR组进一步升高（P＜0.01），提示EF24和放射线具有协同作用。在H460细胞系中情况略有不同，IR组和空白对照组p53表达无差异（1.24±0.13 vs.1.07±0.10，P=0.143），但EF组的p53表达(1.89±0.10)则比空白对照组高（P＜0.01），而IR+EF组的p53表达(2.57±0.17)则比EF组或IR组都要高(P＜0.01)。
　　P53的下游调节因子p21与p53的变化趋势基本一致。A549细胞系空白对照组，EF组，IR组和IR+EF组的p21相对表达比例分别为:1.06±0.06，2.10±0.07，2.99±0.07和6.22±0.33。IR组和EF组的p21表达都明显高于空白对照组（P＜0.01），而IR+EF组的p21表达则比EF组或IR组进一步提高(P＜0.01)。同样在H460细胞系中空白对照组，EF组，IR组和IR+EF组的p21相对表达比例分别为:1.09±0.08，4.68±0.14，5.26±0.37和8.47±0.48。EF组和IR组的p21表达也都明显高于空白对照组（P＜0.01），而IR+EF组的p21表达则比EF组或IR组还要高(P＜0.01)。
　　3、EF24对A549放射残留细胞EMT的影响及机制
　　我们按照文献报道方法建立了A549放射残留细胞EMT模型并应用EF24给予处理，然后通过划痕实验，Transwell侵袭实验和Western blot评估了EF24对EMT的影响并分析了EF24的作用机制。
　　3.1、EF24对A549放射残留细胞迁移能力的影响
　　划痕实验结果显示A549放射残留细胞的迁移能力明显增加，A549放射残留细胞(AR)组的划痕愈合比例1.63±0.21明显高于正常A549细胞(A)组的划痕愈合比例1.00±0.13(P＜0.01)。而采用EF24处理的AR(AR+EF)组划痕愈合比例0.99±0.15则比AR组明显下降（P＜0.01），说明EF24能明显抑制A549放射残留细胞的迁移能力。
　　3.2、EF24对A549放射残留细胞侵袭能力的影响
　　Transwell侵袭实验结果显示A549放射残留细胞的侵袭能力明显增强，AR组的下层细胞比例1.40±0.15明显高于A组的细胞比例1.00±0.11(P＜0.01)。而采用EF24处理的AR+EF组细胞比例1.02±0.10则比AR组明显下降(P＜0.01)，说明EF24能明显抑制A549放射残留细胞的侵袭能力。
　　3.3、EF24对A549放射残留细胞上皮标志因子E-cadherin和间质标志因子N-cadherin蛋白表达的影响
　　结果显示，A组，AR组和AR+EF组的E-cadherin相对表达比例分别为:1.03±0.07，0.70±0.02，和0.97±0.06。A组，AR组和AR+EF组的N-cadherin相对表达比例分别为:1.00±0.09，1.35±0.08和0.93±0.16。AR组的E-cadherin表达较A组明显下降(P＜0.01)，而其N-cadherin表达较A组明显升高(P＜0.01)，说明AR组细胞产生了EMT。采用EF24处理后结果显示AR+EF组的E-cadherin表达比AR组明显回升(P＜0.01)，同时AR+EF组的N-cadherin表达则比AR组明显下降(P＜0.01)，说明EMT现象得到了逆转。
　　3.4、EF24对A549放射残留细胞HIF-1a和pVHL蛋白表达的影响
　　结果显示AR组的HIF-1a相对表达(2.80±0.14)比A组(1.04±0.09)明显升高(P＜0.01，而AR+EF组的HIF-1a相对表达(1.76±0.06)却比AR组明显下降（P＜0.01）。HIF-1a的负向调节因子pVHL则呈现相反的情况，AR组的pVHL相对表达(0.38±0.02)比A组(1.03±0.06)明显下降(P＜0.01)，而EF24能使AR组的pVHL相对表达恢复（从0.38±0.02恢复至1.07±0.05，P＜0.01）。
　　结论:
　　1、EF24可以提高NSCLC细胞系A549和H460细胞的放射敏感性。
　　2、EF24提高A549和H460细胞的放射敏感性的机制，可能是通过上调pVHL并进一步促进细胞凋亡、细胞周期G2/M阻滞、抑制HIF-1a表达实现的。
　　3、EF24可能通过上调pVHL表达从而抑制HIF-1a，逆转A549放射残留细胞的EMT。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 细胞系

2．1．2 主要试剂及耗材

2．1．3 主要仪器设备

2．2 主要实验方法

2．2．1 实验试剂配制及用法

2．2．2 细胞培养

2．2．3 细胞照射方法

2．2．4 克隆形成实验

2．2．5 细胞存活曲线的绘制

2．2．6 放射残留细胞EMT模型建立

2．2．7 Western blot检测

2．2．8 细胞凋亡检测

2．2．9 细胞周期检测

2．2．10 划痕实验

3 实验结果

3．1 EF24对A549和H460细胞放射敏感性的影响

3．2 EF24影响A549和H460细胞放射敏感性的机制

3．2．1 EF24对A549和H460细胞凋亡的影响

3．2．2 EF24对A549和H460细胞周期的影响

3．2．3 EF24对A549和H460细胞照射后蛋白表达的影响

3．3 EF24对A549放射残留细胞EMT的影响及机制

3．3．1 EF24对A549放射残留细胞迁移能力的影响

3．3．2 EF24对A549放射残留细胞侵袭能力的影响

3．3．4 EF24对A549放射残留细胞HIF-1a和pVHL蛋白表达的影响

4 讨论

5 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 乏氧诱导因子-1与肿瘤放射抵抗

攻读学位期间获得的研究成果

致谢

个人简介