利用维甲酸诱导及Wnt5a基因敲除两种颌面发育畸形模型研究腭裂及舌发育异常的分子调控机制及相关性

摘要

以唇腭裂为代表的颌面部发育畸形发病率位于先天性发育畸形的首位。作为多基因易感性疾病，腭裂是由多重环境因素与多个基因交互作用所导致，因此病因复杂，机制不明。一直以来，大多数的腭裂病因学研究者均把目光集中在腭突自身的发育异常，然而，腭裂发生的原因，一是由于腭突内部的缺陷，二是继发于颌面部其他组织的缺陷，如临床上颌发育不足和下颌后缩，导致舌位置异常，从而物理性的阻碍腭突上抬而导致腭裂。但目前颌面部其他组织器官，尤其是作为与腭组织结构、生理功能以及生长发育密切相关的舌发育分子调控机制、及其发育异常与腭裂发生的关联均少见报道。
　　 维甲酸(Retinoicacid，RA)是维生素A的衍生物，作为化妆品添加剂以及治疗皮肤病、癌症等疾病的药物，成为较常见的致畸的环境因素。同时维甲酸通路与WNT及SHH等信号分子通路相互作用共同参与颌面部发育的调控。本研究利用维甲酸诱导及Wnt5a基因敲除两种颌面发育畸形动物模型，通过体内和体外实验，探究腭裂以及舌发育异常的分子调控机制以及二者的相关性。以期加深对舌发育的分子机制的了解，并为腭裂及舌发育异常的预防以及临床治疗提供可能的科学依据。
　　 目的:利用维甲酸诱导及Wnt5a基因敲除小鼠两种颌面部发育畸形动物模型，研究腭裂以及舌发育异常分子调控机制以及二者的相关性。
　　 方法:建立和应用维甲酸诱导及Wnt5a基因敲除两种小鼠颌面部发育畸形模型，体视显微镜及组织染色观察表型的组织形态学变化，BrdU掺入法检测细胞增殖，TUNEL染色方法检测细胞凋亡，Masson染色检测舌肌纤维化，基因芯片筛选腭裂和舌发育异常的差异基因，实时定量PCR验证基因芯片结果，免疫组织化学实验进一步探查WNT信号分子通路GSK3β蛋白以及成肌调节因子家族成员Myf5和MyoD在舌肌中的表达变化。利用Trowell培养系统和去除舌组织的体外器官培养进行腭突的直接接触融合实验，探讨舌与腭发育相关性。
　　 应用稳定转染Wnt5a的C2C12细胞系体外检测Wnt5a对骨骼肌发育的影响，CCK-8法检测C2C12细胞增殖水平及血清饥饿法诱导凋亡后细胞的活性，流式细胞术AnnexinV-FITC/PI双染检测细胞凋亡水平，诱导C2C12细胞肌向分化后，Real-TimePCR检测成肌调节因子成员Myf5、MyoG和Myogenin表达变化，免疫细胞化学法检测骨骼肌特异标志物Myosin的表达，以探讨Wnt5a对肌向分化的影响。
　　 结果:1、利用维甲酸诱导腭裂模型研究颌、舌与腭的发育
　　 (1)腭突组织基因芯片研究分析提示差异基因主要集中在转录调节、生长调节、细胞运动以及细胞骨架等功能，且与WNT和SHH通路相关，尤其是GSK3β和β-TrCP等既参与WNT通路又与SHH信号通路，与腭的发育畸形相关。实时定量PCR技术证明GSK3β及β-TrCP等表达下调，FZD3受体表达无明显变化。免疫组织化学结果显示GSK3β蛋白在E14腭突快速增殖期的腭突上皮和间充质中均有表达，在E15.5腭裂组上颌骨发育明显延迟，GSK3β表达在大量未分化的间充质细胞中。在E14-14.5，腭突开始上抬至发生接触融合的关键时期，实验组腭突仍垂直于舌的两侧，与对照组相比在麦克尔软骨边缘有多个TUNEL阳性凋亡细胞。
　　 (2)在E13.5去除舌组织并利用Trowell系统进行腭器官体外培养3天后，实验组以及对照组双侧腭突都发生了融合，双侧腭突的间充质相互贯通。在E14-16.5侧腭突发育全过程中，腭裂组与对照组颏舌肌细胞核数量无明显差异，但腭裂组肌束横截面的总面积明显小于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，舌肌细胞增殖、凋亡水平无明显差异，未见舌异常纤维化。舌组织基因芯片分析提示，舌发育畸形与维甲酸相关的信号网络相关，DTNA，CAMK2D等表达上调2倍以上。
　　 2、Wnt5a基因对舌及骨骼肌发育的影响
　　 (1)Wnt5a在正常舌发育中的表达呈动态变化，在E13.5舌组织中呈高表达，在E15.5舌组织中的表达明显下调。而且在E15.5，即舌肌分化成熟期，维甲酸诱导腭裂组Wnt5a的表达高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 (2)Wnt5a基因敲除小鼠舌体以及颏舌肌中BrdU阳性率与正常对照组相比无显著差异，对照组颏舌肌的舌间充质出现区域性密集，实验组则不明显。成肌调节因子成员Myf5和MyoD蛋白在舌内外肌群中的表达水平均下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 (3)应用Wnt5a稳定转染C2C12小鼠成肌细胞系，Wnt5a基因上调后第24h、48h和72h，C2C12细胞增殖能力无明显变化(P＞0.05)，经过血清饥饿24h后细胞均发生凋亡，但Wnt5a上调对细胞凋亡和活性无明显影响(P＞0.05)，细胞迁移也无明显变化(P＞0.05)。在体外成功诱导C2C12细胞系肌肉方向分化后，Wnt5a基因上调可引起成肌调节因子的变化，Myf5在分化第2，3天表达下降(P＜0.05)，MRF4在分化第2天表达明显下降(P＜0.05)，Myog的表达在分化第2天(P＜0.05)及第4天(P＜0.01)均下调。细胞免疫化学显示两组细胞都有Myosin的表达，均可形成多核肌管。
　　 结论:过量维甲酸可导致以腭裂为代表的口腔颌面部多器官发育异常，但不影响腭突中嵴上皮细胞接触后的融合。维甲酸诱导腭裂小鼠伴发舌发育延迟、上颌骨发育迟缓以及下颌麦克尔软骨异常凋亡，提示了过量维甲酸可干扰颌面系统协同发育。
　　 维甲酸诱导的腭发育异常与WNT和SHH信号通路相关，维甲酸相关信号网络参与舌的发育异常。体内敲除及体外转染上调Wnt5a基因均可延迟骨骼肌的肌向分化，提示了Wnt5a基因具有多向调控作用。

目录

声明

摘要

第一部分 维甲酸诱导及Wnt5a基因敲除两种颌面发育畸形模型中上下颌发育的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 维甲酸诱导及Wnt5a基因敲除两种颌面发育畸形模型中舌肌肉组织的发育异常及其与腭裂发生的相关性

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 应用稳定转染Wnt5a的C2C12成肌细胞系体外探查Wnt5a对骨骼肌发育分化的作用

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述

附录

致谢