嗜热自养甲烷杆菌二硫键异构酶活性结构及其功能研究

摘要

嗜热自养甲烷杆菌，形态上微型杆状或丝状，无孢子，也不运动，最适生长温度为65℃，是一种专性厌氧嗜热古菌。嗜热自养甲烷杆菌二硫键异构酶(MtPDI)具有促进蛋白质二硫键的形成和异构化的功能，具有分子伴侣活性，在宿主热损伤修复中起着重要的作用。本文对嗜热自养甲烷杆菌进行胁迫处理，发现逆境处理后MtPDI的表达量会增加，并且胁迫处理后的嗜热自养甲烷杆菌菌株形态会发生变化。为进一步研究MtPDI活性结构域中的关键氨基酸位点，本文通过生物信息学推测了MtPDI的活性结构域（C74PAC77），通过对MtPDI的活性结构域进行定点突变，从而研究突变后二硫键异构酶的酶活性是否发生变化以及其在逆境中发挥的作用是否减弱。结果如下：
　　1.MtPDI活性结构域中C74，C77位点进行突变后，MtPDI(C74S)，MtPDI(C77S)，MtPDI(C74S/C77S)的还原酶活性都有所下降，降低的百分比分别为32.2％，40.7%和51.2%，双突变对酶活性影响相比单点突变大。但C74，C77位点进行突变对MtPDI的分子伴侣活性没有影响。
　　2.热处理后，突变体MtPDI(C74S)，MtPDI(C77S)，MtPDI(C74S/C77S)对大肠杆菌的热损伤保护明显低于MtPDI，但是在盐胁迫中，突变前与突变后的菌株长势变化不明显。
　　综上所述，MtPDI活性结构域C74，C77位点氨基酸是其还原酶活性起主要作用的氨基酸。并且对MtPDI活性结构域中C74，C77位点进行突变会影响MtPDI热损伤保护作用。

目录

声明

第1章 绪论

1.1 嗜热自养甲烷杆(Methanothermobacter.thermoautotrophicus)

1.2 蛋白折叠

1.3 二硫键异构酶(protein disulfide isomerase, PDI)

1.4 嗜热自养甲烷杆菌二硫键异构酶（MtPDI）

1.5 定点诱变技术

1.6 研究内容与创新点

第2章 非生物胁迫对嗜热自养甲烷杆菌形态和MtPDI蛋白表达的影响

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

第3章 嗜热自养甲烷杆菌二硫键异构酶(MtPDI)关键氨基酸位点突变体的构建

3.1 实验材料

3.2 试验方法

3.3 结果与分析

第4章 嗜热自养甲烷杆菌二硫键异构酶(MtPDI) 关键氨基酸位点突变体原核表达

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

第5章 体外检测嗜热自养甲烷杆菌二硫键异构酶（MtPDI）突变体酶活性

5.1 验实材料

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

第6章 嗜热自养甲烷杆菌（MtPDI）突变体对E. coli的耐受性的分析

6.1 实验材料

6.2 实验方法

6.3.结果与分析

第7章 结论

7.1 结论

7.2 讨论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果