禽病原性大肠杆菌E058株iucA、iucAiutA基因及sit与aerobactin操纵子基因突变株的构建及其生物学特性研究

摘要

禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli，APEC)引起的一种常见的局部或全身性感染的细菌性传染病，且易与其它病原性细菌、病毒并发或混合感染。目前，该病已成为危害养禽业的重要细菌病，给世界范围内养禽业造成了巨大的经济损失。
　　 病原性大肠杆菌天然形成了特定利用铁元素的摄取系统(specific iron assimilation system)，这一系统由气杆菌素(aerobactin)的合成以及气杆菌素特定的外膜蛋白受体（由iutA编码）两部分组成。Williams最早在大肠杆菌中发现了这一系统，细菌的这两种成分在铁含量很少的情况下，均能被强烈地诱导表达。Lafont等研究表明，气杆菌素合成的相关基因只存在于有毒力的菌株，在无毒力菌株中并没有发现。编码气杆菌素的5个基因，共处于一个操纵子，位于ColⅤ这一大质粒上，其中参与气杆菌素合成的是iucA、iucB、iucC和iucD4个基因，而iutA编码一种膜蛋白受体。本研究旨在探讨编码气杆菌素的iucA、iutA基因以及aerobactin和sit操纵子与APEC致病性间的关系，了解APECiucA、iutA以及aerobactin和sit操纵子基因突变株的生物学特性，为了解APEC的致病机理和特异性防治措施奠定基础。
　　 本研究运用同源重组的方法构建了E058△iucA、E058△iucA△iutA及E058△vir基因缺失突变株，其中vir包括sit及aerobactin操纵子的15kb大小的片段。同时将含iucA完整阅读框的质粒pGEX-6P-1-iucA电转化突变株E058△iucA，从而筛选获得回复株Re-E058△iucA。PCR扩增带酶切位点的iucA基因并插入到pBSK载体的多克隆位点中，然后运用分子克隆方法将Zeocin抗性基因插入到目的基因iucA中，构建出带Zeocin抗性基因的质粒pS-iucA-Zeo。PCR扩增片段iucA-Zeo，并电转化入带有质粒pKD46的禽病原性大肠杆菌分离株E058中，运用同源重组的方法，筛选出基因突变株E058△iucA，将片段iutA-Kan电转化入带有质粒pKD46的单突变株E058△iucA中，筛选出双突变株E058△iucA△iutA。以质粒pUC4K为模板，PCR扩增片段，电转化带有质粒pKD46的E058菌株中，运用同源重组的方法，筛选出基因突变株E058△vir。
　　 Southernblot结果表明Zeocin、Kanamycin抗性基因在APECE058突变株质粒中的插入是单拷贝的;RT-PCR结果表明iucA、iutA基因的缺失只影响其本身的表达，而未影响其上下游基因的表达。Aerobactinproduction试验结果显示突变株E058△iucA、E058△iucA△iutA、E058△vir不能产生aerobactin，而野生株E058、回复株Re-E058△iucA都可以产生aerobactin。生长曲线的测定结果显示突变株E058△iucA、E058△iucA△iutA、E058△vir和亲本株E058在生长速度上没有显著差异;E058、E058△iucA、E058△iucA△iutA及E058△vir株的半数致死量(LD50)分别为104.4、105.0、104.8和105.0CFU;鸡巨噬细胞HD-11吞噬试验结果表明突变株与亲本株的侵袭能力没有显著差异;体外竞争结果显示，突变株较E058株轻度致弱;体内竞争实验表明，与野生株E058相比，突变株E058△iucA、E058△iucA△iutA毒力高度致弱;动态分布试验结果表明，突变株E058△iucA在心血中含菌量是12CFU.ml-1(p＜0.001)，肝脏含菌量6.3×102CFU.g-1(p＜0.001)，脾脏含菌量7.1×103CFU.g-1(p＜0.01)，肺脏含菌量7.8×103CFU.g-1(p＜0.001)，肾脏含菌9.4×102CFU.g-1(p＜0.001)，E058△iucA△iutA心血带菌量15CFU.ml-1(p＜0.001)，肝脏含菌量94CFU.g-1(p＜0.001)，脾脏含菌量9.1×102CFU.g-1(p＜0.001)，肺脏含菌量3.6×103CFU.g-1(p＜0.001)，肾脏含菌量1.4×102CFU.g-1(p＜0.001)，E058△vir心血带菌量15CFU.ml-1(p＜0.001)，肝脏含菌量1.05×102CFU.g-1(p＜0.001)，脾脏含菌量3.2×103CFU.g-1(p＜0.001)，肺脏含菌量6.8×103CFU.g-1(p＜0.001)，肾脏含菌量96CFU.g-1(p＜0.001)，而E058在脏器中的含菌量分别是心血8.2×102CFU.ml-1，肝脏4.2×104CFU.g-1，脾脏8.8×104CFU.g-1，肺脏1.3×105CFU.g-1，肾脏3.7×104CFU.g-1，与野生株相比，三株突变株均为高度致弱。

目录

摘要

符号说明

综述

禽病原性大肠杆菌E058株iucA、iucAiutA基因及sit与aerobactin操纵子基因突变株的构建及其生物学特性研究

1 材料

1．1 菌株和质粒

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

1．4 分子生物学及数据分析软件

1．5 试验鸡及试验鸡胚

2 方法

2．1 pS-iucA-Zeo重组质粒的构建

2．2 制备电转化感受态细胞及其转化

2．3 双突变株E058△iucA△iutA的构建

2．4 sit操纵子及aerobactin操纵子突变株E058Avir的构建

2．5 Southem杂交

2．6 RT-PCR

2．7 突变株的回复拯救试验

2．8 E058△iucA、E058△iucA△iutA及E058△vir突变株生物学特性

2．9 E058△iucA、E058△iucA△iutA及E058△vir突变株的致病性评价

3 结果

3．1 pS-iucA-Zeo质粒的获得

3．2 突变株E058△iucA、E058△iucA△iutA及E058△vir的鉴定

3．3 Southern blot鉴定结果

3．4 RT-PCR结果

3．5 E058及突变株E058△iucA、E058△iucA△iutA和E058△vir的生长曲线

3．6 突变株的回复拯救结果

3．7 Aerobactin production试验结果

3．8 HD-11细胞吞噬试验结果

3．9 SPF鸡血清杀菌试验结果

3．10 LD50测定结果

3．11 体外体内竞争结果

3．12 21日龄SPF鸡体内动态分布试验结果

4 讨论

全文小结

参考文献

致谢

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