江苏某猪场2015-2016年猪流行性腹泻病毒分子流行病学调查及基于S蛋白的抗体间接ELISA检测方法的建立

摘要

猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(PorcineEpidemic Diarrhea Virus，PEDV)引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，是目前世界范围内猪场多发的猪病之一。自2010年10月以来，猪流行性腹泻病的流行强度和流行区域在不断地加强和扩大，尤其对哺乳仔猪致死率较高，可高达100％。在很多接种过PED疫苗的猪场，本病发病率及仔猪死亡率仍居高不下，并出现与其他病原混合感染的现象，大大增强了该病的防控难度，也给养猪业造成了巨大的经济损失。因此，对PED的诊断及其抗体监测具有重要意义。虽然目前，已有多种PED的诊断和抗体监测技术，如全病毒包被的ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)等。但全病毒包被ELISA存在大量制备抗原困难、有散毒危险等缺点。IFA则需要昂贵的特殊设备，不适用于临床检测。利用蛋白表达分子生物学技术建立间接ELISA方法成为检测PEDV抗体新的方向。
　　本研究从江苏某猪场进行间断性采样方法以对猪流行性腹泻病毒进行分子流行病学调查，利用表达纯化的S蛋白建立了检测其抗体的间接ELISA检测方法，可进一步了解江苏某猪场PED的流行特点，评价猪群感染或免疫抗体，为猪群PED疫苗选择及免疫疫苗后的抗体检测提供理论指导及检测手段。
　　1.江苏某猪场PEDV分子流行病学调查
　　为了解江苏某猪场PEDV的流行情况，应用RT-PCR方法对2015年3月至2016年3月间从江苏某猪场采集的106份疑似猪流行性腹泻样品进行PEDV检测，检测结果显示PEDV阳性率为30.19％(32/106)，猪场内各年龄段的猪均有出现PEDV感染的现象。设计了针对M、N和ORF3基因的特异性引物，对其中2个阳性样品进行全长扩增，并将扩增的产物进行测序。测序结果与国内外相应的基因序列进行比对并构建遗传进化树，发现目前分离PEDV参考株主要分为G1、G2两大支，而该猪场的流行毒株位于G1支上，基于ORF3基因的遗传进化树分析可推测，猪场流行毒为PEDV野毒，与国内流行毒相近。
　　2.PEDV部分S基因的原核表达
　　PEDV的S蛋白在免疫介导中起着重要作用，因此本研究对猪场流行毒株的部分S基因（编码蛋白可产生中和抗体，标记为Sp）进行扩增，长度为711 bp，进一步克隆至pET-32a，构建了pET-Sp原核表达质粒。重组表达质粒转化BL21感受态细胞后，在28℃、200 rpm条件下，经0.2 mM浓度的IPTG诱导获得可溶性重组S蛋白。Western-blot试验证明表达的重组蛋白可与PEDV阳性血清发生特异性反应，说明该重组蛋白有较好的抗原性。
　　3.PEDV抗体间接ELISA检测方法的初步建立
　　为监测猪场猪群PEDV抗体水平，初步建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方法。纯化的S蛋白作为包被抗原，最优的包被浓度为0.5μg/ml，4℃包被过夜，10％的小牛血清37℃封闭2h，最优的待检血清稀释度为1∶200，37℃作用1h，HRP标记的兔抗猪IgG1∶8000稀释，37℃作用1h，加入TMB显色液10 min后终止反应。当待检血清OD450≥0.273时判为阳性，待检血清OD450＜0.273时判为阴性。用建立的间接ELISA方法对商品化试剂盒中PRRSV、CSFV、PRV、PCV、FMDV等常见猪病的抗体阳性对照进行检测均呈阴性，说明该方法具有良好的特异性。分别用不同批次纯化的蛋白及同一批次纯化蛋白包被的酶标板对血清样品进行检测，结果表明该方法具有较好的重复性。用建立的间接ELISA方法对临床47份猪血清进行检测，阳性率为72.34％，与进口某公司PEDV抗体ELISA检测试剂盒结果进行比较，其符合率为95.74％。说明该方法适用于临床猪群PEDV抗体水平检测，同时也为以后诊断试剂盒的研制奠定基础。

目录

摘要

符号说明

文献综述

参考文献

第一章 江苏某猪场PEDV分子流行病学调查

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第二章 猪流行性腹泻病毒部分S基因的原核表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第三章 PEDV抗体间接ELISA检测方法的建立

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

全文小结

致谢

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