单核细胞增生李斯特菌p60蛋白异源表达条件的优化及其抑菌效果的研究

摘要

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)简称单增李斯特菌，是一种自然界普遍存在的人畜共患病病原菌，也是一种食源性病原菌，它能引起人、畜的李斯特菌病。食品中存在的单增李斯特菌威胁着人类的安全，该菌在温度较低的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。Lm-p60蛋白为单核细胞增生李斯特菌产生的一种胞外蛋白，由iap基因编码，与李斯特菌的致病性密切相关。Lm-p60蛋白具有酰胺水解酶的活性，能够水解细菌细胞壁，具有很高的研究价值。
　　Lm-p60蛋白的三级结构预测及结构域功能的研究结果显示:Lm-p60蛋白存在着N端和C端两个独立的结构域，其中N端结构域存在两个LysM结构域和一个SH3结构域，而C端只含有一个NlpC/P60家族结构域。Lm-p60蛋白在裂解细菌细胞壁的过程中，只有N端结构域中的LysM和SH3具有结合底物功能，从而确定了N端结构域行使识别并结合底物的功能，而C端结构域行使裂解底物功能。目前，Lm-p60蛋白是否具有抗菌性及抗菌效果如何还不是很清楚，而且Lm-p60蛋白在异源表达过程中还存在表达量不足和活性较低的问题。为了获得大量高活性Lm-p60蛋白，本研究通过SDS-PAGE分析比较不同载体构建的重组蛋白的表达量来确定最适表达载体，结果表明最适表达载体为pET30a。随后，本研究以SDS-PAGE分析和比浊法测重组蛋白裂解细菌细胞壁活性确定了以pET30a载体构建的重组蛋白最佳诱导表达条件是:在细菌培养至OD600值为0.553时加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，在摇床温度为30℃，转速为160rpm条件下诱导培养4h。然后通过SDS-PAGE分析和比浊法测裂解活性确定了最佳超声波破碎时间为20min。在最佳条件下诱导表达并用镍柱亲和层析纯化Lm-p60蛋白，通过计算后Lm-p60蛋白的纯化倍数为1.2，回收率达95％。
　　细菌抗药性及耐药性问题日益突出，开发新的抗菌剂十分迫切。Lm-p60蛋白具有裂解细菌细胞壁的活性，研究Lm-p60蛋白是否具有抗菌作用及抗菌效果如何成为一项重要的工作。本研究以溶壁微球菌为指示菌，琼脂打孔法确定了Lm-p60蛋白具有抑菌活性，其抑菌效果比溶菌酶要弱。溶菌酶作为研究较为透彻的抗菌酶，其裂解细胞壁原理与Lm-p60蛋白有所不同，本研究发现，在溶菌酶中混合有Lm-p60蛋白后具有增强抑菌效果的重要结论。为溶菌酶的改造提供很好的材料。本研究还以pET30a载体构建Lm-p60蛋白的N端结构域与LysM2-C端重组蛋白。并通过比浊法测定发现N端结构域也具有裂解活性，但抑菌效果不明显，同时还发现只含有一个LysM结构域的C端重组蛋白裂解活性较弱。

目录

摘要

缩略语与符号语说明

第一章 文献综述

1．1 单核细胞增生李斯特菌概述

1．2 Lm的主要毒力因子及其致病机理

1．3 Lm-p60蛋白是一种由Lm分泌的胞外蛋白

1．4 Lm-p60蛋白具有水解肽聚糖的活性

1．5 Lm-p60蛋白的结构域

1．5．1 LysM结构域

1．5．2 SH3结构域

1．5．3 NlpC／P60家族结构域

1．6 研究意义

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株、质粒与引物

2．1．2 试剂与材料

2．1．3 主要仪器

2．2 溶液配制

2．3 实验方法

2．3．1 以pET30a为载体表达全长Lm-p60蛋白的重组质粒的构建

2．3．2 以pET32a为载体表达全长Lm-p60蛋白的重组质粒的构建

2．3．5 异源表达Lm-p60蛋白最佳原核表达载体的确定

2．3．6 以pET30a为载体构建的全长Lm-p60蛋白诱导表达条件的确定

2．3．7 大肠杆菌异源表达Lm-p60蛋白最佳超声波破碎提取时间的确定

2．3．8 异源表达Lm-p60蛋白的纯化及回收率计算

2．3．10 带有His标签的Lm-p60融合蛋白大量表达纯化及平板打孔法测蛋白抗菌效果

2．3．11 Lm-p60蛋白N端及LysM2-C端结构域重组蛋白大量表达纯化及抗菌效果的测定

第三章 实验结果

3．1 重组表达质粒的构建与鉴定

3．2 Lm-p60蛋白最适原核表达载体的确定

3．3 以pET30a为载体构建的p60蛋白表达条件的优化

3．3．1 诱导剂IPTG加入时机对Lm-p60蛋白表达量及活性的影响

3．3．3 IPTG浓度对Lm-p60蛋白表达量及活性的影响

3．3．4 诱导时间对Lm-p60蛋白表达量及活性的影响

3．3．5 诱导时摇床转速对Lm-p60蛋白表达量及活性的影响

3．4 超声波破碎时间对大肠杆菌异源表达Lm-p60蛋白质提取率的影响

3．5 异源表达带His标签的Lm-p60融合蛋白亲和纯化条件的确定

3．5．2 最佳条件下诱导表达Lm-p60蛋白纯化回收率计算

3．6 带His标签的Lm-p60融合蛋白裂解溶壁微球菌细胞壁活性最适温度的测定

3．8 琼脂打孔法测带有His标签的Lm-p60融合蛋白的抗菌效果

3．9 琼脂打孑L法测带有His标签的Lm-p60融合蛋白与溶菌酶混合使用的抗菌效果

3．10 Lm-p60蛋白的N-端和LysM2-C-端结构域的His-标签融合蛋白的表达和纯化

3．11 Lm-p60蛋白的N-端和LysM2-C端结构域的带His标签的融合蛋白裂解细菌细胞壁活性和抗菌效果

第四章 讨论

参考文献

致谢

声明