溴氰菊酯胁迫下果蝇基因表达谱及蛋白酶体β亚基与抗性关系的研究

摘要

溴氰菊酯由于其生物活性优异、环境相容性较好，在防治卫生害虫和农作物害虫中占有重要地位。然而随着溴氰菊酯的广泛及不合理的使用，昆虫普遍对其产生了不同程度的抗药性。发现和研究新的抗药性相关基因将有助于阐明抗药性的分子基础和寻找新的治理抗性的靶标。 基因芯片是一种重要的高通量基因组学研究技术，在功能基因组、系统生物学、药物基因组的研究中已经得到了广泛的应用，对于揭示基因组的结构与功能已经并正在发挥重要的推动作用。随着不同昆虫完整的、被诠释的基因组序列的出现，昆虫抗药性的基因组学研究为昆虫抗性机理研究和抗性防治工作提供新思路和新途径。 本实验室前期工作以小菜蛾抗性品系和敏感品系为材料采用cDNA代表性差异分析（cDNA representative difference analysis，cDNA RDA）结合荧光定量PCR(qPCR)，活体水平通过RNA干扰(RNA interference，RNAi)后低表达、细胞水平通过细胞转染后高表达首次发现，泛素基因(ubiquitn)家族成员UBL40与小菜蛾溴氰菊酯抗性相关，为进一步阐明杀虫剂抗性的分子机制和建立抗药性检测方法提供了新的科学依据。在此基础上，本研究以果蝇细胞作为模式系统，适当浓度的溴氰菊酯处理的细胞为实验组进行了大规模的基因芯片杂交分析。结果如下: (1)根据倒置显微镜下细胞形态的观察和细胞毒性检测结果表明15 ppm的溴氰菊酯处理时细胞有较高的存活率。 (2)以15 ppm浓度处理的细胞作为实验组，正常状态的细胞和农药溶剂处理的细胞作为对照组，分别提取RNA并反转录成cDNA进行基因芯片杂交，获得448个2倍以上差异表达的基因序列。 (3) GeneOntology(GO)分析表明这些基因主要参与信号转导、小泡和分子运输、蛋白质的合成和降解、免疫反应等细胞和分子代谢，其中大多数差异表达的基因是否与溴氰菊酯抗药性相关有待进一步实验验证。 (4)溴氰菊酯诱导下蛋白酶体β2亚基(Prosbeta2)的表达量上调了2.2倍，该亚基参与26S蛋白酶体的形成。将Prosbeta2转染果蝇Kc细胞后，细胞对溴氰菊酯的抗药性水平有一定的提高，表明Prosbeta2与果蝇细胞的溴氰菊酯抗性相关。 综上所述，溴氰菊酯胁迫下能诱导大量基因差异表达，为进一步阐明杀虫剂抗性的分子机制和建立抗药性检测方法提供了新的科学依据，具有重要的理论意义和潜在的实际应用价值。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 昆虫抗药性的形成机理

1．1．1 抗性形成学说

1．1．2 抗性机理概述

1．2 抗药性的防治策略

1．2．1 综合治理

1．2．2 混合用药

1．2．3 使用增效剂

1．2．4 镶嵌式防治

1．3 蛋白酶体

1．3．1 蛋白酶体概述

1．3．2 蛋白酶体结构与功能

1．3．3 蛋白酶体相关研究进展

1．4 基因芯片技术的发展

1．5 基因芯片技术在昆虫抗药性研究中的应用

第2章 果蝇细胞培养与溴氰菊酯胁迫下细胞毒性检测

2．1 实验材料

2．1．1 供试果蝇细胞

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器与耗材

2．2 实验方法

2．2．1 细胞传代培养

2．2．2 溴氰菊酯诱导果蝇细胞

2．2．3 倒置显微镜下细胞形态特征变化

2．2．4 细胞毒性检测

2．3 实验结果

2．3．1 溴氰菊酯诱导的细胞形态的变化

2．3．2 溴氰菊酯诱导的细胞毒性的变化

2．4 讨论

第3章 基因芯片检测溴氰菊酯胁迫下基因表达谱的变化

3．1 实验材料

3．1．1 供试果蝇细胞

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 细胞处理

3．2．2 总RNA的提取和纯化

3．2．3 一步法合成cDNA的两条链

3．2．4 荧光标记cRNA合成与纯化

3．2．5 cRNA样品片段化和芯片杂交(4×44K microarrays)

3．2．6 实时荧光定量PCR验证

3．2．7 免疫印迹分析

3．3 实验结果

3．3．1 基因芯片筛选溴氰菊酯诱导的差异表达基因

3．3．2 将筛选得到的差异表达基因进行Gene ontology分类分析

3．3．3 qRT-PCR验证部分筛选到的差异表达基因

3．3．4 WesternBlot检测蛋白水平的表达

3．4 讨论

第4章 蛋白酶体β2亚基过表达与溴氰菊酯抗性的关系

4．1 实验材料

4．1．1 供试果蝇细胞

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器和耗材

4．2 实验方案

4．2．1 总RNA的提取和反转录

4．2．2 蛋白酶体β2亚基基因克隆

4．2．3 昆虫表达载体的构建

4．2．4 昆虫表达载体重组质粒转染果蝇细胞

4．2．5 重组质粒的表达鉴定

4．2．6 细胞毒性检测

4．3 实验结果

4．3．1 目的基因的克隆

4．3．2 转染细胞后Prosbeta2表达量变化

4．4 讨论

结论

参考文献

在读学位期间的研究成果

致谢