斜生栅藻诱导型防御的权衡策略与代价分析及在转录组水平上的差异

摘要

在生态系统各营养级中，许多生物为了抵御较高营养级的捕食作用，在与其捕食者的长期协同进化过程中形成了多种多样的防御方式。防御方式按防御的时效性可分为诱导型防御和组成型防御。栅藻（Scenedesmus spp.）是一类具有典型诱导防御的藻类，在全球范围内的淡水水体中广泛存在。栅藻能够响应枝角类、轮虫等的信息素，形成4细胞、8细胞甚至更多细胞的真定型群体。防御理论认为，任何形式的防御均伴随着代价。栅藻形成防御群体后，由于比表面积的降低，导致“包裹效应”和较高的沉降速率，因此栅藻的诱导型防御必然伴随着代价的产生。然而以往的众多研究均未能观察到栅藻在形成防御群体时付出的直接代价（如生长率的下降）。栅藻诱导型反牧食防御作为诱导防御理论研究的重要模式系统，对于其代价的研究已然是亟待解决的重要问题。本文以斜生栅藻(S.obliquus)为对象，研究在环境资源可得性不足时诱导型防御群体的产生是否会伴随着直接的生长代价。此外，当环境中存在多重的选择压力时，防御代价的存在必然会导致生物在表达防御和抵御其他环境压力间权衡。因此，本文从种间竞争、环境污染物胁迫以及长期反复施加牧食压力等方面开展了研究，以探讨栅藻诱导型反牧食防御在多重环境压力下的权衡策略和代价表现。同时，本文利用高通量测序手段研究斜生栅藻表达诱导型反牧食防御群体时在转录组水平上的变差异表达，以揭示斜生栅藻诱导型反牧食防御策略的内在调控机制。本文的研究结果主要包括以下6个方面:
　　1、斜生栅藻诱导型反牧食防御在环境资源可得性受限时存在权衡和直接代价
　　在研究中发现，斜生栅藻诱导型反牧食防御的表达依赖于充足的环境资源。当环境资源可得性降低时，栅藻的防御强度受到影响。不同的环境资源对栅藻防御的影响不同。光照强度降低限制了栅藻防御群体的形成;最大防御群体大小随磷元素水平的下降而有降低的趋势;氮元素水平的降低不会影响防御的最大值，然而低氮水平下防御群体的持续时间延长了。在镁和钙两种金属元素缺乏时，栅藻不能形成防御群体。在环境中磷元素和镁离子缺乏时，栅藻形成防御型群体伴随着较高的生长代价，生长率表现出显著的下降。在对缺氮和缺磷状态下栅藻胞外固着性、溶解性多聚糖和胞内多聚糖的测定中发现，大型溞滤液显著提高了栅藻胞内和胞外多聚糖的含量。缺氮时栅藻合成更多的多聚糖，而缺磷时多聚糖的含量差异不显著。研究结果表明，光照强度、磷元素、镁离子和钙离子的缺乏时栅藻存在防御和生长间的权衡，防御群体显著减少以维持较高的生长率;氮元素缺乏却显著延长了防御群体持续的时间;在磷元素和镁离子缺乏时，栅藻形成防御群体伴随着直接的生长代价。
　　2、斜生栅藻种间竞争和诱导型反牧食防御的权衡
　　斜生栅藻在面临种间竞争和捕食压力双重压力时，在形成大但是沉降较快的多细胞（有利于防御）和形成小却容易被牧食的单细胞、（有利于竞争）两种细胞形式间存在权衡。在与铜绿微囊藻、小球藻和针杆藻共存时，栅藻防御强度显著削弱;并且形成防御群体的栅藻在竞争压力下表现出显著的生长抑制，栅藻的竞争能力下降。栅藻防御强度与环境中共存的其他藻类的生物量负相关;共存者生物量很高时，栅藻减少防御群体的表达，以维持较高的竞争能力。实验结果表明，诱导型反牧食防御的表达所伴随的代价导致了栅藻在面临多重选择压力时存在必要的权衡策略。
　　3、藻类和大型水生植物的次生代谢产物影响斜生栅藻的诱导型反牧食防御
　　本实验研究了斜生栅藻在微囊藻毒素(MC-LR)和大型水生植物浸提液影响下诱导型反牧食防御群体形成的变化。实验结果表明，MC-LR作用下栅藻诱导型防御群体的变化不显著，且未显著影响栅藻的正常生长。而四种大型水生植物的浸提液却促使栅藻产生更多的防御群体;不仅如此，栅藻的正常细胞增殖也受到了显著的影响。实验结果表明，MC-LR对栅藻生长和防御的干扰较弱;大型植物在与栅藻共存时产生的次生代谢产物对栅藻防御群体的形成有促进作用，但是显著干扰了栅藻的正常生长。
　　4、重金属和表面活性剂干扰了斜生栅藻防御群体的形成
　　实验中发现，非致死浓度下重金属锌(Zn2+)严重抑制了斜生栅藻对大型溞信息素的响应。温度升高显著增强了Zn2+对栅藻的毒性作用。三种表面活性剂（十二烷基硫酸钠SDS、十二烷基二甲基苄基溴化铵BZK和壬基酚聚氧乙烯醚NPE40)在很低的浓度下对栅藻诱导型防御群体的形成存在非常显著的干扰。其中阴离子表面活性剂SDS不仅促进了栅藻形成更多的防御群体，并且在无大型溞信息素存在时能够诱导栅藻形成群体;阳离子表面活性剂BZK和非离子表面活性剂NPE40抑制了栅藻防御群体的形成。实验中还发现四种环境污染物对于栅藻群体防御的影响存在显著的浓度相关性，即随着污染物浓度的升高影响更为显著。实验结果表明环境污染物干扰了栅藻诱导型反牧食防御的形成。
　　5、长期反复的大型溞信息素诱导下斜生栅藻诱导型防御的权衡
　　本实验设置了两种不同的长期反复诱导模式:1.当斜生栅藻防御群体基本消失后再次诱导;2.当栅藻防御群体达到峰值时再次诱导。在实验中发现，在两种反复诱导模式下，栅藻防御群体的最大值均有随着诱导次数增加而下降的现象。在第一种模式下，栅藻防御群体强度于第4个周期时出现显著的削弱，而在10个周期的反复刺激后，防御群体仍能维持在2.5个细胞左右。在第二种模式下，栅藻群体防御能力迅速下降，于第4个周期时已降至最大群体大小低于2.5个细胞，第5个周期后防御群体低于2个细胞，已基本无法形成有效的防御。实验结果表明，栅藻防御群体会随着多次反复的信息素刺激而削弱，且与刺激的频率和周期有显著的相关性。
　　6、转录组水平的研究揭示了栅藻诱导型反牧食防御的内在调控机制
　　本实验通过高通量测序技术，研究了斜生栅藻诱导型反牧食防御在转录组水平上的机制。测序结果显示，栅藻诱导型反牧食防御可能是通过磷酸肌醇代谢途径和植物—寄生者相互关系途径接收并传递防御信号;通过上调光合固碳途径合成更多的碳水化合物，上调淀粉和蔗糖代谢以及半乳糖代谢途径生产多聚糖的原料。并且还发现众多下调途径（如核糖体的生物合成，过氧化物酶系，叶酸的生物合成等），说明栅藻防御群体的形成以细胞内蛋白质生物合成降低，抗氧化体系的抑制以及细胞分裂等为代价。
　　综上所述，本研究发现，在资源受限、竞争、环境胁迫等条件下斜生栅藻在形成防御群体时伴随着显著的直接代价，且存在防御策略的权衡策略，同时揭示了栅藻诱导型反牧食防御的内在调控机制。本研究结果完善了栅藻诱导型反牧食防御理论，对于推动种间关系的研究也具有重要意义。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 藻类的诱导型反牧食防御

1．1．1 藻类的组成型防御

1．1．2 藻类的诱导型防御

1．2 诱导型反捕食防御的代价

1．3 生存环境不利时生物诱导型反捕食防御的权衡策略

1．3．1 环境资源水平下降时，生物在生长与防御间的权衡策略

1．3．2 种间关系影响生物诱导防御

1．3．3 污染物等环境胁迫时生物抵御胁迫和捕食双重压力的权衡策略

1．4 本文的研究目的和内容

1．4．1 研究目的

1．4．2 主要研究内容

1．4．3 研究框架图

1．4．4 本研究的主要创新点

第2章 斜生栅藻诱导型反牧食防御在资源可得性降低时的代价和权衡策略

2．1 引言

2．2 材料方法

2．2．1 实验生物

2．2．2 大型溞滤液的制备

2．2．3 斜生栅藻的活化

2．2．4 实验设计

2．2．5 培养基

2．2．6 培养体系中总磷和总氮的测定

2．2．7 栅藻生长和形态的观察

2．2．8 栅藻细胞活体叶绿素荧光参数的测定

2．2．9 栅藻细胞叶绿体色素的测定

2．2．10 栅藻细胞多聚糖含量的测定

2．3 结果

2．3．1 光照强度对斜生栅藻诱导型反牧食防御的影响

2．3．2 培养基浓度水平对斜生栅藻诱导型反牧食防御的影响

2．3．3 氮元素水平对斜生栅藻诱导型反牧食防御的影响

2．3．4 磷元素对斜生栅藻诱导型反牧食防御的影响

2．3．5 镁离子水平对斜生栅藻诱导型反牧食防御的影响

2．3．6 钙离子水平对斜生栅藻诱导型反牧食防御的影响

2．3．6 氮、磷缺乏对斜生栅藻多聚糖含量的影响

2．4 讨论

2．5 本章小结

第3章 斜生栅藻在竞争能力与反牧食防御间的权衡

3．1 引言

3．2 材料方法

3．2．1 实验生物

3．2．3 藻类初始密度比的确定

3．2．3 藻种的活化

3．2．4 实验设计

3．2．5 竞争抑制指数的计算

3．2．6 种群密度曲线

3．3 结果

3．3．1 斜生栅藻在铜绿微囊藻存在时诱导型反牧食防御的权衡策略

3．3．2 斜生栅藻在小球藻存在时诱导型反牧食防御的权衡策略

3．3．3 斜生栅藻在针杆藻存在时诱导型反牧食防御的权衡策略

3．4 讨论

3．5 本章小结

第4章 水生植物和其他藻类的次生代谢产物对斜生栅藻诱导型反牧食防御的影响

4．1 引言

4．2 材料方法

4．2．1 实验生物

4．2．2 大型溞滤液的制备

4．2．4 大型水生植物浸出液的获得及实验设计

4．3 结果

4．3．1 微囊藻毒素MC-LR对斜生栅藻诱导型反牧食防御的影响

4．3．2 大型水生植物浸出液对斜生栅藻诱导型反牧食防御的影响

4．4 讨论

4．5 本章小结

第5章 环境污染物对斜生栅藻诱导型反牧食防御的干扰

5．1 引言

5．2 材料方法

5．2．1 实验生物

5．2．3 实验设计

5．3 结果

5．3．1 锌浓度对斜生栅藻诱导型反牧食防御的影响

5．3．2 表面活性剂对斜生栅藻诱导型反牧食防御的影响

5．4 讨论

5．5 本章小结

第6章 斜生栅藻在长期反复的捕食者信息素刺激下诱导型防御的权衡

6．1 引言

6．2 材料方法

6．2．1 实验生物

6．2．3 实验设计

6．3 结果

6．3．1 斜生栅藻防御群体消失后再次诱导

6．3．1 栅藻防御群体达到峰值时再次诱导

6．4 讨论

6．5 本章小结

第7章 斜生栅藻诱导型反牧食防御群体形成在转录组水平上的差异

7．1 引言

7．2 材料方法

7．2．1 实验生物

7．2．2 测序前处理

7．2．3 栅藻总RNA的提取和转录组的测序

7．2．4 转录组测序原始数据的统计、质控、去杂处理和序列的拼接

7．2．4 拼接结果的注释

7．2．5 基因表达量分析

7．2．9 COG分类

7．2．11 Gene Ontology功能显著性富集分析

7．2．12 Pathway显著性寓集分析

7．2．13 差异表达基因的实时荧光定量PCR(qPCR)验证

7．3 结果

7．3．1 斜生栅藻在不同培养条件下的表型变化和生长率

7．3．2 斜生栅藻在不同培养条件下的RNA-seq

7．4 讨论

7．5 本章小结

第8章 总结与展望

参考文献

发表论文、资助与获奖情况

致谢