RNA干涉Dotll表达对小鼠卵母细胞减数分裂和附植前胚胎发育的影响

摘要

近年来，随着表观遗传学研究的不断深入，组蛋白共价修饰的机制以及它与细胞周期调控、生长、发育、疾病发生等多种生物过程的作用逐渐成为研究热点。不同的组蛋白修饰参与了细胞周期调控、转录、DNA断裂修复等多种细胞活动。小鼠中组蛋白H3K79的甲基化酶Dotll是H3K79一、二、三甲基化状态的唯一的催化酶。Dotll在DNA双链断裂修复、基因活化转录及细胞周期调控方面都发挥作用。组蛋白H3K79的三甲基化对于Sir蛋白在端粒处凝聚至关重要，该蛋白可以维持异染色质基因沉默。H3K79甲基化缺失时，使Sir蛋白远离这些沉默区域并进入常染色质位点，而无法完成端粒定位。H3K79二甲基化对于DNA修复也有作用。检验点蛋白53BP1能通过其保守的tudor域，间接与甲基化的Lys79结合，由此激活检验点途径修复DNA损伤。
　　 小鼠GⅤ期卵母细胞阻滞于第一次减数分裂的双线期，此时染色质的同源重组已经基本完成，只留有重组结。尽管在酵母的研究中证明DOT1是减数分裂粗线期的检验点，dot1的突变会导致无存活能力的孢子增加，对于小鼠Dotll在GⅤ期到MⅡ期卵母细胞中的作用并未明朗。本试验拟通过胞质注射Dotll siRNA的方法，干涉Dotll在卵母细胞中的表达，并在此基础上，观察卵母细胞的减数分裂情况，并探究可能的原因。
　　 1.干涉Dotll表达对卵母细胞减数分裂的影响
　　 我们通过软件设计出针对小鼠Dotll的siRNA，并化学合成。取GⅤ期卵母细胞，随机分为三组，前两组分别注射Dotll siRNA、scramble RNA，第三组作为未注射对照组。注射后，在添加有IBMX的IVM液中培养24h后，通过荧光定量PCR技术检测Dotll mRNA水平、通过免疫荧光技术和Westernblot检测Dotll蛋白水平、通过免疫荧光技术检测H3K79me2变化。结果表明:注射Dotll siRNA可以极显著地降低卵母细胞内Dotll mRNA水平，显著降低Dotll蛋白水平，极显著地降低H3K79me2的水平。将各组卵母细胞在IVMI液中培养24h后，移入IVM培养液，恢复减数分裂，并观察GVBD和MⅡ进程。结果表明:注射Dotll siRNA的卵母细胞可以顺利通过GVBD，但阻滞在MⅠ前中期。进一步使用检验点蛋白BubR1进行免疫荧光染色发现，siRNA注射组卵母细胞的染色体端粒上附着有大量BubR1，提示Dotll缺乏会造成动粒和纺锤丝不能建立合适的连接，而无法进入MⅠ后期。十月龄小鼠和三周龄小鼠卵母细胞H3K79me2、me3的免疫荧光对比试验发现，老龄小鼠卵母细胞的H3K79me2水平极显著地低于幼龄小鼠;老龄小鼠卵母细胞的H3K79me3较之幼龄小鼠也明显减少。最后，我们检测了Dotll siRNA注射后，卵母细胞的乙酰化水平。结果表明，siRNA注射后,卵母细胞的H3K27乙酰化和H4K12乙酰化水平都显著地上升，表现为去乙酰化不全。
　　 在小鼠附植前胚胎中，H3K79me2在有丝分裂期表达，在间期不表达;而H3K79me3在附植前发育阶段都没有表达。我们通过给原核期胚胎注射Dotll siRNA来干涉Dotll在小鼠附植前胚胎中的表达，并在此基础上观察胚胎的发育、转录活性、核型等指标，借此来阐明Dotll在小鼠附植前胚胎发育中的作用。
　　 2.干涉Dotll表达对小鼠附植前胚胎发育的影响
　　 小鼠卵母细胞体外受精后5h，挑选具有两个原核的胚胎，随机分为三组，前两组分别注射Dotll siRNA、scramble RNA，第三组作为未注射对照组。将三组胚胎移入KSOM培养液进行体外培养。在受精后24h采样，通过荧光定量PCR技术检测2细胞胚胎Dotll mRNA水平;在IVF后45h采集4细胞间期样品，通过免疫荧光技术检测Dotll的蛋白水平;在50h采集4细胞M期样品，通过免疫荧光技术检测H3K79me2水平。结果表明:注射siRNA能极显著地降低2细胞期Dotll mRNA水平;能极显著地降低4细胞间期Dotll蛋白水平;能显著降低4细胞M期H3K79me2水平。将三个处理组的胚胎置于KSOM培养液中进行体外发育，在24h、48h、72h、96h分别观察胚胎发育情况。结果表明，注射siRNA能极显著减慢胚胎的发育时程。针对三组胚胎分别做4细胞期、8细胞期和桑椹胚期的转录活性检测，结果表明各组胚胎直接没有显著差别。三组胚胎进行体外培养至囊胚后，进行TUNEL检测和核型分析。结果表明:注射Dotll siRNA可以显著增加囊胚细胞凋亡率，可以显著增加囊胚细胞非整倍体比率。
　　 本试验揭示了小鼠GⅤ期卵母细胞缺失Dotll会导致染色体动粒与纺锤体无法形成合适的连接而使卵母细胞停滞于MⅠ前中期，并导致整个染色体乙酰化水平升高。小鼠附植前胚胎Dotll缺失会导致胚胎发育率下降，细胞凋亡比率增加，非整倍体比率增加。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略语的中英文对照

第一章 组蛋白H3K79甲基转移酶Dot1／KMT4及H3K79甲基化研究进展

1 组蛋白共价修饰概述

1．1 组蛋白甲基化

1．2 组蛋白的乙酰化和去乙酰化

1．3 组蛋白的磷酸化

1．4 组蛋白泛素化

2 组蛋白修饰在配子形成和胚胎发育中的作用

3 Dot1及H3K79甲基化的研究进展

3．1 DOT1的分子结构及甲基化机制

3．2 Dot1／DOT1L(DOT1-Like)的分子结构以及催化H3K79甲基化的原理

3．3 Dot1的催化功能需要H4尾巴的参与

3．4 H2B泛素化对Dot1催化H3K79三甲基化功能的调节

3．5 DotCom复合体及Dot1-MLL复合体的工作原理

3．6 Dot1和H3K79甲基化在有丝分裂细胞周期调控和DSBs修复中的作用

3．7 DOT1参与监控DNA损伤的检验点机制

3．8 Dot1l参与细胞内DNA损伤修复过程

3．9 DOT1在端粒沉默区域的作用

3．10 Dot1在减数分裂粗线期检验点的功能

3．11 Dot1和H3K79me在发育中的作用

4 本研究目的与意义

参考文献

第二章 胞质注射Dot1l siRNA对小鼠卵母细胞减数分裂的影响

1 材料与方法

1．1 实验动物

1．2 试剂与仪器

1．3 溶液配制

1．4 Dot1l siRNA的设计、合成和稀释分装

1．5 GV期卵母细胞的获取

1．6 GV期卵母细胞显微注射

1．7 GV期卵母细胞的体外成熟(IVM)培养

1．8 常规免疫荧光检测

1．9 免疫荧光相对定量分析

1．10 小鼠卵母细胞cDNA模板的合成

1．11 实时荧光定量RT-PCR

1．12 卵母细胞的Westernblot分析

1．13 数据统计分析

2 结果

2．1 小鼠卵母细胞减数分裂过程中Dot1l、H3K79二甲基化(me2)和三甲基化(me3)的变化

2．2 小鼠卵母细胞减数分裂过程中Dot1l mRNA的存留

2．3 注射Dot1l siRNA后GV期卵母细胞中Dot1l mRNA水平下降

2．4 注射Dot1l siRNA对GV期卵母细胞内Dot1l蛋白含量的影响

2．5 Dot1l siRNA注射对GV期卵母细胞内H3K79me2含量的影响

2．6 Dot1l siRNA注射对卵母细胞减数分裂的影响

2．7 注射Dot1l siRNA可以保持检验点蛋白BubR1在染色体端粒的驻留

2．8 幼龄小鼠和老龄小鼠卵母细胞中H3K79甲基化水平比较

2．9 注射Dot1l siRNA的卵母细胞乙酰化水平升高

3．讨论

3．1 Dot1l及H3K79甲基化在小鼠GV期到MⅡ期卵母细胞中的分布

3．2 通过显微注射siRNA干涉卵母细胞内目标基因的可行性

3．3 干涉Dot1l阻滞小鼠卵母细胞进入MⅠ后期

3．4 老龄小鼠卵母细胞中H3K79甲基化水平下降

3．5 干涉Dot1l表达引起小鼠卵母细胞的乙酰化水平升高

参考文献

第三章 干涉小鼠原核期Dot1l的表达对胚胎发育的影响

1 材料与方法

1．1 实验动物

1．2 试剂与仪器

1．3 溶液配制

1．4 Dot1l siRNA的设计、合成和稀释分装

1．5 体外受精(IVF)及胚胎培养

1．6 原核期胚胎显微注射

1．7 胚胎的体外培养(IVC)

1．8 小鼠胚胎细胞cDNA模板的合成

1．9 实时荧光定量RT-PCR

1．10 常规免疫荧光检测

1．11 转录活性检测

1．12 早期胚胎TUNEL凋亡检测

1．13 免疫荧光相对定量分析

1．14 囊胚细胞核型分析

1．15 数据统计分析

2 结果

2．1 原核期胞质注射siRNA后2-细胞胚胎Dot1l mRNA的含量下降

2．2 原核期胞质注射siRNA后4-细胞间期胚胎Dot1l蛋白含量下降

2．3 原核期胞质注射siRNA后4-细胞有丝分裂期胚胎H3K79me2水平下降

2．4 原核期胞质注射siRNA后小鼠附植前胚胎的发育率降低

2．5 原核期胞质注射siRNA后小鼠囊胚细胞数减少

2．6 原核期胞质注射siRNA后小鼠胚胎的体外转录活性并未降低

2．7 原核期胞质注射siRNA后小鼠胚胎的细胞凋亡率增加

2．8 原核期胞质注射siRNA后小鼠胚胎的非整倍体率增加

3 讨论

参考文献

全文结论

创新

附录

1 文中未提及的试剂及耗材

1．1 抗体货号及分装保存

1．2 其他试剂及耗材

2 主要仪器

3 主要溶液的配制

3．1 HTF、M2液配制方法

3．2 KSOM培养液配方

3．3 M2I、IVM和IVMI液的配制

3．4 酸性台式液的配制

3．5 简易PBS配方

3．6 部分试剂工作液或浓储液的配制

致谢

博士研究生期间发表的文章