Functional Characterizations of Cell Death-Inducing Effectors in Phytophthora Capsici

摘要

卵菌疫霉属可引起多种植物毁灭性病害，其中辣椒疫霉菌可以侵染45种以上的栽培植物和杂草。当外界环境比较湿热时，目前尚无有效的化学防控、耕作策略或抗病品种来控制辣椒疫霉菌引起的植物病害。辣椒疫霉菌由游动孢子介导靶向寄主植物起始侵染，侵染过程中，它分泌大量的效应因子来干扰植物的免疫反应。这些效应因子可以分成胞外和胞内效应因子两类。其中胞外效应因子在寄主植物的细胞外发挥作用，而胞内效应因子在病原菌分泌到病原菌胞外后进一步转运进入植物细胞发挥功能，这些效应因子都能干扰植物的免疫反应促进病原菌的侵染。然而，我们对这些效应因子促进病原菌的侵染的作用机制还知之甚少，本研究对数十个辣椒疫霉菌两类胞内效应因子进行了功能筛选，获得了数个具有细胞死亡诱导活性的效应因子，进一步分析其毒性/无毒功能和机制。取得的主要结果如下:
　　PcCRN4在植物细胞核中诱导细胞死亡和抑制植物防卫反应。利用农杆菌介导植物瞬时表达技术，在本氏烟和普通烟叶片上分析了47个CRN效应因子的细胞死亡诱导活性，发现其中有3个CRN效应因子（PcCRN4，PcCRN23和PCCRN42）可以在本氏烟叶片上诱导细胞死亡，其中PcCRN4能在本氏烟、普通烟和番茄上上同时诱导明显的细胞死亡。基因表达分析表明PcCRN4基因在侵染阶段上调表达。在本氏烟中过量表达PcCRN4基因可以显著促进辣椒疫霉菌的侵染。亚细胞定位分析表明PcCRN4定位在植物的细胞核。将PcCRN4蛋白融合核定位信号(NLS)或核输出信号(NES)分析其定位对PcCRN4功能的影响，明确了该效应因子的核定位是其诱导细胞死亡和促进侵染所必须的。沉默PcCRN4基因显著降低了辣椒疫霉菌的致病性。与接种野生型辣椒疫霉菌比较，接种PcCRN4沉默转化子后本氏烟中的病程相关蛋白基因PR1b的表达显著上调;并且接种沉默转化子的植物叶片中胼胝质积累明显增多，表明沉默该效应因子降低了辣椒疫霉菌抑制植物防卫反应的能力。利用野生型和沉默转化子接种拟南芥，通过比较细胞死亡相关基因的表达初步明确PcCRN4诱导植物细胞死亡的机制。实验结果显示接种野生型病原菌后拟南芥中细胞死亡正调控因子AtMC1和AtLSD1的表达显著高于接种沉默转化子，而细胞死亡抑制因子AtBI-1的表达显著低于接种沉默转化子，而另一个细胞死亡正调控因子PAD4的表达没有明显差别，表明PcCRN4可以通过影响细胞死亡相关基因的表达来促进植物细胞死亡。总之，我们的实验结果表明辣椒疫霉菌PcCRN4是一个重要的毒性效应因子，该效应因子需要定位到细胞核来抑制寄主活性氧和胼胝质积累等免疫反应，进而促进病原菌的侵染。
　　PcRxLR242可被寄主和非寄主植物识别诱导免疫反应。我们通过农杆菌介导的植物瞬时表达技术，在本氏烟和普通烟中分析了68个辣椒疫霉菌RxLR效应因子的细胞死亡诱导活性。鉴定到3个能够在本氏烟叶片上诱导细胞死亡的效应因子PcRxLR242，PcRxLR207和PcRxLR214;其中PcRxLR242，PcRxLR207可以同时在本氏烟和普通烟上诱导细胞死亡，而PcRxLR242的死亡诱导活性更强。进一步分析发现PcRxLR242在另一种茄科植物番茄上也能够诱导细胞死亡。亚细胞定位分析发现PcRxLR242定位在细胞质和细胞核。在本氏烟中瞬时表达该效应因子提高了其对辣椒疫霉菌的抗性。接种PcRxLR242基因沉默转化子后的植物病斑显著大于接种对照菌株。与接种对照菌株相比，接种沉默转化子后本氏烟中的病程相关蛋白基因PR1b明显下调;DAB染色结果显示接种PcRxLR242沉默转化子后接种点的H2O2积累较之接种对照菌株少，表明该基因可能是辣椒疫霉菌的一个无毒基因。有趣的是，我们发现PcRxLR242沉默转化子可以成功侵染辣椒疫霉菌的非寄主普通烟。这些结果表明PcRxLR242可能是一个无毒效应因子，寄主植物和非寄主植物识别该基因后可以植物抗病反应。

目录

声明

Contents

ABBREVIATIONS

FIGURE LEGENDS

LIST OF TABLES

摘要

ABSTARCT

CHAPTER ONE：1．0 General introduction

1．1 General objective

1．2 Specific objectives

CHAPTER TWO：Research background

2．0 Phytophthora capsici

2．1 Lifecycle of Phytophthora capsici

2．2 Phytophthora capsici effectors

2．2．1 RxLR effectors

2．2．2 Crinkler (CRN) effectors

2．3 Molecular Plant-Pathogen Interactions

2．3．1 PAMP Triggered Immunity(PTI)．

2．3．2 Effector Triggered Immunity(ETI)

2．4 Localization Phytophthora effectors

CHAPTER THREE：A virulence essential CRN effector of phytophthora capsici suppresses host defense and induces cell death in plant nucleus

3．1 Introduction

3．2 Materials and Methods

3．2．1 Plasmid construction

3．2．2 Agrobacterium tumefaciens infiltration assays

3．2．3 Pathogenicity assay

3．2．4 Phytophthora capsici inoculation and in vitro samples

3．2．5 RNA extraction and real time quantitative RT-PCR

3．2．6 Protein extraction and Western blot

3．2．7 Confocal microscopy

3．2．8 Stable silencing of PcCRN4 in P.capsici

3．2．9 Oxygen burst detection and Callose deposition assay

3．2．10 Trypan blue staining

3．3 Results

3．3．1 Identification of PcCRN4 homologs and cell death induction in three plants

3．3．2 PcCRN4 is expressed at infection stages

3．3．3 PcCRN4 requires nuclear localization to trigger cell death

3．3．4 PcCRN4 enhances Phytophthora virulence on N. benthamiana and decreases ROS accumulation

3．3．5 PcCRN4 is required for full virulence

3．3．6 Silenced line exhibits reduced invasive hyphae，ability to reduce H2O2 accumulation and callose deposition

3．3．7 In planta expression of PcCRN4 recovers virulence of the silenced line

3．3．8 PcCRN4 may manipulate cell death by regulating expression of celldeath-related genes

3．4 Discussion

CHAPTER FOUR：Overexpression of Phytophthoracapsici effector RxLR242 induces cell death，disease and defense responses in Nicotiana benthamiana

4．1 Introduction

4．2 Materials and Methods

4．2．1 Plasmid construction

4．2．2 Agrobacterium tumefaciens infiltration assays

4．2．3 Pathogenicity assay

4．2．4 Phytophthora capsici inoculation and in vitro samples

4．2．5 RNA extraction and real time quantitative RT-PCR

4．2．6 Protein extraction and Western blot

4．2．7 Confocal microscopy

4．2．8 Stable silencing of PcRxLR242 in P.capsici

4．2．9 Oxygen burst detection

4．2．10 Trypan blue staining

4．2．11 Generation of Tobacco Rattle Virus(TRV)-Based Virus-Induced Gene Silencing (VIGs)N.benthamiana plants

4．3 Resuits

4．3．1 Overexpression of PcRxLR242 induce cell death in planta

4．3．2 PcRxLR242 is expressed highly at early infection stages

4．3．3 PcRxLR242 protein localization in the cytosol

4．3．4 Expression of PcRxLR242 reduces plant susceptibility to P.capsici

4．3．5 Silencing PcRxLR242 increases plant susceptibility to P.capsici

4．3．6 PcRxLR242-silenced lines enhances virulence on N.tabacum

4．4 Discussion

CONCLUSIONS AND SUMMARY

REFERENCES

PUBLICATIONS

ACKNOWLEDGEMENTS