CVC1302/CVC1303对PEDV灭活疫苗免疫增强机制初探

摘要

在世界范围内，病毒性传染病已经对畜牧养殖业造成非常严重的损失。目前对家禽家畜进行疫苗接种是控制传染病最有效的手段。然而即使养殖场按照免疫程序进行免疫接种，很多情况下家畜仍然难以产生有效的免疫应答。因而在免疫接种同时应用免疫增强剂成为目前提高疫苗免疫效力的重要手段之一。 CVC1302、CVC1303是由江苏省农业科学院国药中心开发研制，并通过仔猪动物试验证实:可以提高机体对猪圆环疫苗、猪流行性腹泻灭活疫苗以及口蹄疫灭活疫苗的免疫应答，能够提高抗体产生水平，从而提高疫苗的免疫效果，同时还能够缩短免疫窗口期，延长保护期。 本文通过小鼠免疫模型来评价免疫增强剂CVC1302对猪流行性腹泻灭活疫苗的疫苗免疫反应的效力，并研究免疫增强剂CVC1303对猪流行性腹泻灭活疫苗产生黏膜免疫反应的影响，为进一步了解免疫增强剂作用机理提供依据。本文具体开展的试验研究和取得的结果如下: 1.CVC1302对PEDV灭活疫苗免疫增强机制初探 评价添加免疫增强剂CVC1302的猪流行性腹泻灭活疫苗对小鼠的体液免疫、细胞免疫的影响。使用6～8周龄ICR雌性鼠作为试验动物模型。将小鼠分成以下几个免疫组进行免疫注射:(1)高剂量免疫增强剂CVC1302与猪流行性腹泻灭活疫苗免疫组;(2)中剂量免疫增强剂CVC1302与猪流行性腹泻灭活疫苗免疫组;(3)低剂量免疫增强剂CVC1302与猪流行性腹泻灭活疫苗免疫组;(4)仅使用猪流行性腹泻灭活疫苗的免疫组;(5)PBS注射组。二次免疫后第30天采集血液，分离血清，检测特异性抗体IgG及亚类(IgG1、IgG2a)的效价;同时分离小鼠脾淋巴细胞，分别进行淋巴细胞增殖试验以及通过流式细胞仪检测CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞亚群分化、树突状细胞表面共刺激因子。再通过使用PEDV抗原刺激小鼠脾脏细胞后获取细胞上清进行IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α细胞因子的检测。结果表明，在体液免疫反应检测中，与对照组相比，高、中浓度的CVC1302均能显著地提高小鼠血清中特异性抗体IgG及亚类，而低浓度1302则显著提高IgG及亚型IgG1水平，对IgG2a提高不显著。在细胞免疫检测中，高浓度的CVC1302免疫增强剂能够显著提高T淋巴细胞增殖，通过流式检测CD3+CD4+、CD3+CD8十T细胞比例都有所提高以及Th1、Th2类细胞因子的分泌，同时促进树突状细胞的成熟。而中、低高浓度的CVC1302免疫增强提升并不显著。综上所述，免疫增强剂CVC1302能有效提高树突状细胞的成熟，提高其抗原递呈能力，激活T淋巴细胞的活性以及分化，提高免疫小鼠体液免疫细胞免疫反应以及Th1、Th2型相关细胞因子的产生，从而提高PEDV灭活疫苗的免疫效力，从而为开发新型的、促进疫苗反应的免疫增强剂提供了实验依据。 2.CVC1303对PEDV灭活疫苗免疫增强机制初探 评价添加免疫增强剂CVC1303的猪流行性腹泻灭活疫苗对小鼠免疫后抗体水平、黏膜免疫、细胞免疫的影响。使用6～8周龄ICR雌性鼠作为试验动物模型。将小鼠分成以下几个免疫组进行免疫注射:(1～3)高、中、低三种剂量免疫增强剂CVC1303与猪流行性腹泻灭活疫苗免疫组;(4)仅使用猪流行性腹泻灭活疫苗的免疫组;(5)PBS注射组。二免后第30天采集小鼠血清检测特异性IgG及亚型抗体水平;同时采集小鼠脾脏单核细胞通过流式细胞仪检测CD3+CD4+细胞比例以及DC细胞共刺激因子，收集细胞上清检测细胞因子IL-4、IL-6;采集小鼠、小肠冲洗液以及肺灌洗液检测特异性抗体IgA效价，以及截取小肠片段进行免疫组化试验，分析IgA+细胞分布情况。结果表明，在二免后30天，与对照组相比，不同剂量组能显著或极显著提高小鼠血清中IgG、IgG1水平，CD3+CD4+细胞比例以及DC细胞共刺激因子以及细胞因子均有显著的提高。而高剂量CVC1303免疫增强剂能极显著提高小鼠小肠黏膜中特异性抗体IgA的水平，而中、低浓度1303免疫增强剂对于小鼠小肠黏膜中IgA的提升不明显。同时截取小肠片段制备免疫组画图片，分析小鼠小肠片段中IgA+细胞分布情况，其中高剂量CVC1303免疫增强剂能极显著提高小鼠小肠黏膜中IgA+细胞水平。在二次免疫后47天，对截取受免小鼠小肠获取小肠灌洗液，冲洗小鼠肺部获取肺灌洗液，结果显示高剂量的CVC1303买验组小鼠小肠和肺部黏膜IgA水平高于PEDV组。综上所述，高剂量的CVC1303免疫增强剂能有效提高PEDV疫苗的黏膜免疫反应以及血清中抗体的产生同时能够促进树突状细胞的成熟以及相应细胞因子的表达，从而为开发新型的、促进黏膜免疫反应的免疫增加剂提供了实验依据。

目录

声明

摘要

缩略语

1猪流行性腹泻简介

1．1猪流行性腹泻病毒的生物学特性

1．2猪流行性腹泻的流行病学

1．3猪流行性腹泻感染的发病机理

1．4临床症状

1．5病理变化

1．6 PED疫苗的研究进展

1．7猪流行性腹泻常规疫苗目前存在的问题

2免疫增强剂的研究进展

2．1免疫增强剂种类

2．2免疫增强剂的免疫调节作用

第二章CVCl302对PEDV灭活疫苗免疫增强机制初探

1材料

1．1试验动物

1．2主要试剂

1．3主要仪器

2试验方法

2．1疫苗与免疫增强剂的制备

2．2试验动物分组和免疫程序

2．3血样采集

2．4 PEDV特异性IgG及亚型ELISA检测

2．5 T淋巴细胞增殖试验

2．6流式细胞术检测

2．7细胞因子检测

3结果

3．2 CVC1302对血清特异性IgG亚型IgG1／IgG2a水平的影晌

3．3 CVC1302对T淋巴细胞增殖能力的影响

3．4 CVC1302对T淋巴细胞亚型的影响

3．5 CVC1302对树突状细胞的影响

3．6 CVCl302对脾淋巴细胞中细胞因子IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α表达水平的影晌

4讨论

参考文献

第三章CVC1303对PEDV灭活疫苗的免疫增强机制初探

1材料

1．1试验动物

1．2主要试剂

1．3主要仪器

2试验方法

2．1疫苗与免疫增强剂的制备

2．2动物分组和免疫程序

2．3小肠样品以及小肠肠道冲洗液的采集

2．4小鼠肺灌洗液的采集

2．5小鼠血清采集

2．6 PEDV特异性IgG及亚型检测

2．7小鼠黏膜免疫特异性IgA水平检测

2．8小肠免疫组化图片制作以及分析

2．9流式细胞术检测

2．10细胞因子检测

3结果

3．3 CVC1303对血清特异性IgG亚型IgG2a水平的影响

3．4 CVC1303免疫增强剂对小鼠黏膜特异性IgA抗体水平的影响

3．5小鼠小肠特异性IgA分泌型细胞分布情况

3．6 CVC1303对T淋巴亚型的影响

3．7 CVC1303对树突状细胞的影响

3．8 CVC1303对脾淋巴细胞中细胞因子IL-4、IL-6、IFN-γ表达水平的影响

4讨论

结论

致谢

个人简历