EB病毒编码的BARF1基因通过激活Wnt/β-catenin信号转导途径改变胃癌细胞生物学行为机制的初步研究

摘要

目的：探讨EBV病毒BARF1基因对胃癌细胞生物学行为和相关基因表达状况的影响，及其在Wnt/β-catenin信号转导通路中的作用。
　　 方法：
　　 1)以pSG5空载体稳定转染的胃癌细胞系SGC-7901(SGC-pSG5)为对照，采用细胞计数法和FCM分析pSG5-BARF1重组质粒稳定转染细胞(SGC-BARF1)的增殖能力和细胞周期；以细胞计数法和DNA琼脂糖凝胶电泳法分析紫杉醇诱导后的细胞凋亡状况。
　　 2)以实时荧光定量PCR和免疫印迹法，分析SGC-BARF1细胞中bcl-2、cyclin D1、c-myc和c-met的mRNA和蛋白表达情况。
　　 3)用免疫印迹法分析SGC-BARF1细胞中β-Cat和GSK3β蛋白及其磷酸化水平。
　　 4)用PI3-K特异性抑制剂LY294002处理后，以免疫印迹法分析SGC-BARF1细胞中β-Cat、Cyclin D1和c-Myc蛋白，以及β-Cat蛋白的磷酸化水平。
　　 结果：
　　 1)与对照细胞组相比，SGC-BARF1细胞增殖速度加快，处于G0/G1期的细胞比例减少，而处于S期的细胞比例增高(P＜0.05)；其抵抗紫杉醇诱导细胞凋亡的能力明显增强(p＜0.05)。
　　 2)与对照细胞组相比，SGC-BARF1细胞中bcl-2、cyclinD1、c-myc和c-met基因的mRNA和蛋白表达量均显著增加(p＜0.05)。
　　 3)与对照细胞组相比，SGC-BARF1细胞浆和细胞核内β-Cat蛋白水平均增加，胞浆内GSK3β蛋白减少，而胞核内GSK3β蛋白磷酸化水平提高。
　　 4)经LY294002处理后，SGC-BARF1细胞中β-Cat、Cyclin D1和c-Myc总蛋白量均明显减少，胞浆内GSK3β蛋白的量却相对明显增加。而SGC-pSG5对照变化不明显。
　　 结论：BARF1通过PI3-K激活Wnt/β-catenin信号转导通路，引起bcl-2、cyclin D1、c-myc和c-met等靶基因的表达上调，从而诱导胃上皮细胞的生物学行为的改变。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写索引

声明

第一章绪论

1.1研究背景

1.1.1 EBVaGC中病毒癌基因的表达

1.1.2 BARF1基因的研究进展

1.1.3 EBV相关NPC与Wnt/β-catenin通路

1.1.4 EBVaGC与Wnt/β-catenin通路

1.1.5 LMP2A与Wnt/β-catenin通路

1.1.6 LMP1与Wnt/β-catenin通路

1.1.7 BARF1与Wnt/β-catenin通路?

1.1.8小结

1.2研究的目的与意义

1.3研究内容与技术路线

1.3.1研究内容

1.3.2技术路线

第二章SGC-BARF1和SGC-pSG5细胞中BARF1表达状况的鉴定

2.1材料

2.1.1细胞系

2.1.2抗体

2.1.3试剂与耗材

2.1.4主要仪器

2.2方法

2.2.1 RNA提取与逆转录

2.2.2 PCR

2.2.3 IFA

2.2.4 WB

2.3结果：

2.4讨论

第三章BARF1基因对胃癌细胞生物学行为的影响

3.1材料

3.1.1细胞系

3.1.2试剂与耗材

3.1.3主要仪器

3.2方法

3.2.1细胞增殖实验

3.2.2细胞周期测定

3.2.3细胞凋亡测定

3.2.4统计学分析

3.3结果

3.3.1 BARF1对胃癌细胞增殖的影响

3.3.2 BARF1对胃癌细胞抗凋亡能力的影响

3.4讨论

第四章BARF1基因对胃癌细胞基因表达的影响

4.1材料

4.1.1细胞系

4.1.2抗体

4.1.3试剂与耗材

4.1.4主要仪器

4.2方法

4.2.1 RTFQ-PCR

4.2.2 WB

4.2.3统计学处理

4.3结果

4.3.1 BARF1对胃癌细胞bcl-2基因表达的影响

4.3.2 BARF1对胃癌细胞cyclinD1基因表达的影响

4.3.3 BARF1对胃癌细胞c-myc基因表达的影响

4.3.4 BARF1对胃癌细胞c-met基因表达的影响

4.4讨论

第五章BARF1对胃癌细胞Wnt/β-catenin通路的影响

5.1材料

5.1.1细胞

5.1.2抗体

5.1.3试剂与耗材

5.1.4主要仪器

5.2方法

5.2.1 WB

5.3结果

5.3.1细胞内β-Cat蛋白水平分析

5.3.2细胞内GSK3 β蛋白及其磷酸化水平分析

5.3.3 PI3-K抑制对细胞Wnt/β-catenin通路的影响

5.4讨论

第六章结论与展望

6.1结论

6.2展望

参考文献

致谢

硕士期间发表的论文和参加的课题