长链非编码RNA UCA1作为竞争性内源RNA促进胰腺癌中KRAS和YAP1的表达

摘要

目的： 探讨UCA1能否作为竞争性内源RNA维持KRAS、YAP1在胰腺癌细胞中的稳定表达。 方法： 在生物信息数据库中分析正常胰腺组织及胰腺癌组织中UCA1的表达水平，进一步分析UCA1表达量与胰腺癌患者生存期的关系。通过生物信息学分析UCA1与KRAS、YAP1表达量的相关性，并预测UCA1与KRAS、YAP1之间共享的miRNA。用qRT-PCR分别检测Patu8988、PANC-1、BxPC-3及SW1990四种胰腺癌细胞UCA1的相对表达水平；构建UCA1干扰质粒pLKO.1-sh-UCA1（sh-UCA1），用干扰质粒sh-UCA1进行慢病毒包装，收集病毒并感染UCA1表达量相对较高的胰腺癌细胞，筛选稳转细胞株；将UCA1质粒瞬时转染至UCA1表达量相对较低的胰腺癌细胞中，并用qRT-PCR分别检测干扰及过表达效率。Western blot和qRT-PCR分别检测过表达及敲减UCA1胰腺癌细胞中KRAS、YAP1的相对表达量。RNA免疫共沉淀（RIP）实验检测UCA1与预测miRNA的结合情况，并据此筛选目标miRNA。qRT-PCR检测过表达或敲减UCA1后目标miRNA的表达量变化。Western blot和qRT-PCR分别检测过表达目标miRNA后KRAS和YAP1在蛋白质及mRNA水平的变化。双荧光素酶报告基因实验（dual-luciferase reporter assay）验证目标miRNA与UCA1、KRAS、YAP1的靶向结合作用，突变结合位点进一步验证上述结果。 结果： 分析Oncomine数据库发现，与正常胰腺组织相比，胰腺癌组织中UCA1呈高表达（P<0.05）。分析Cancer Browser数据库发现，UCA1高表达的胰腺癌患者比UCA1低表达者生存时间较短（P<0.05）；UCA1、KRAS 及 YAP1 在胰腺癌组织中的表达呈正相关。利用microRNA.org数据库发现，UCA1可能作为竞争性内源RNA与KRAS mRNA共享miR-590-3p、miR-1271、miR-143、miR-193b和miR-193a-3p；与YAP1 mRNA共享miR-18a、miR-18b和miR-495。四种胰腺癌细胞中SW1990细胞UCA1表达量相对最高，BxPC-3 次之，PANC-1 的表达量相对最低。sh-UCA1 质粒在 BxPC-3、SW1990细胞中具有较强干扰效率（P<0.05）；UCA1过表达质粒在Patu8988、PANC-1细胞中具有较强过表达效果（P<0.05）。在BxPC-3、SW1990细胞中干扰UCA1的表达后，KRAS及YAP1的表达量在蛋白质及mRNA水平均减少（P<0.05）；在Patu8988、PANC-1细胞中过表达UCA1后，KRAS及YAP1的表达量在蛋白质及mRNA水平均增加（P<0.05）。UCA1可靶向结合miR-18a、miR-18b、miR-590-3p、miR-1271、miR-143、miR-193a-3p （P<0.05），但对miR-495、miR-193b无明显结合作用。在Patu8988、PANC-1细胞中过表达UCA1后，miR-590-3p、miR-18a的表达水平均减少（P<0.05）；反之，在BxPC-3、SW1990 细胞株中干扰 UCA1 的表达后， miR-590-3p、miR-18a 的表达水平均增加（P<0.05）。在BxPC-3、SW1990细胞中，过表达miR-590-3p及miR-18a后，UCA1的表达水平均下降（P<0.05）；过表达 miR-590-3p 后 KRAS 的表达量在蛋白质及 mRNA水平均减少（P<0.05）；过表达miR-18a后YAP1的表达量在蛋白质及mRNA水平均减少（P<0.05）。MiR-590-3p、miR-18a显著抑制野生型UCA1载体的荧光素酶活性（P<0.05）；miR-590-3p明显抑制野生型KRAS 3'UTR载体的荧光素酶活性（P<0.05）；miR-18a明显抑制野生型YAP1 3'UTR载体的荧光素酶活性（P<0.05）。UCA1可逆转miR-590-3p、miR-18a分别导致的野生型KRAS 3'UTR、YAP1 3'UTR载体荧光素酶活性下降。 结论： UCA1在胰腺癌组织中的表达量较胰腺正常组织高，且UCA1高表达胰腺癌患者预后较低表达者差。UCA1差异性表达于四种胰腺癌细胞系中。UCA1与KRAS竞争性结合miR-590-3p从而上调KRAS的表达，与YAP1竞争性结合miR-18a从而上调YAP1的表达。

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