氟化钠对昆虫细胞(Sf9)的毒性及蛋白质组学研究

摘要

近年来，自然界中由氟化物造成的污染较为严重。氟化物的过量累积会对环境产生不可避免的负面作用，危及人类的健康，影响生物的生长发育，导致生物链的破坏，从而影响生态环境的平衡。有关氟化物毒性分子机制方面的研究很多，但氟化物对昆虫细胞的毒性影响及其机制仍然不太清楚。本文以Sf9 (Spodoptera frugiperda 9)细胞为研究对象，致力于研究氟化钠(NaF)对细胞形态、细胞活性与增殖、细胞凋亡与坏死、蛋白质表达以及细胞代谢的影响，力求阐述NaF对昆虫细胞毒性的作用机制。本研究为当前NaF污染引起的细胞毒性研究提供参考，同时，也为氟污染的治理提供理论依据。主要的研究结果如下： 1. NaF对Sf9细胞形态及细胞活性增殖的影响。 (1) NaF处理后Sf9细胞形态发生变化：不同浓度NaF (0, 1×10?5, 1×10?4, 1×10?3, 1×10?2, 1×10?1 M)处理Sf9细胞0 h，48 h和72 h，用倒置显微镜观察细胞形态变化。结果显示：处理组细胞随着NaF浓度的增加以及培养时间的增长，细胞逐渐变大、变圆、聚团生长、细胞膜边缘模糊、细胞破碎并且内容物流出，高浓度NaF处理的细胞密度很低，说明NaF是以时间-浓度梯度依赖性的方式对Sf9细胞形态产生毒性的。 (2) NaF处理后Sf9细胞活性下降，细胞增殖被抑制：不同浓度的NaF (0, 1×10?5, 1×10?4, 1×10?3, 2×10?3, 2.5×10?3, 5×10?3, 7.5×10?3, 1×10?2 M)处理Sf9细胞72 h，CCK-8试剂盒检测Sf9细胞活性的变化情况。相比于对照组细胞，细胞活性随NaF处理浓度的增加而显著降低，并由此计算出了NaF在72 h对Sf9细胞的半抑制浓度(half inhibitory concentration) IC50为5.919×10-3 M。同时，细胞增殖实验结果表明，高浓度NaF (0, 2×10?3, 5×10?3, 10?2 M)以时间-剂量依赖性的方式，抑制了Sf9细胞的正常增殖。 2. NaF对Sf9细胞凋亡和细胞坏死的影响 不同浓度NaF (0, 1×10?5, 1×10?4, 1×10?3, 1×10?2 M)处理Sf9细胞72 h，细胞形态凋亡结果显示，随着处理浓度的增加，显示绿色荧光的正常细胞数逐渐减少，橘黄色和红色荧光的凋亡细胞数显著增多。不同浓度NaF处理72 h或半抑制浓度NaF处理不同时间的Sf9细胞凋亡情况检测结果显示，随着NaF处理浓度的逐渐增加及处理时间的延长，早期凋亡、晚期凋亡及坏死细胞数显著性上升，而正常细胞数明显下降，并且在高浓度和长时间NaF处理组细胞中其DNA出现了片段化现象。以上实验结果表明，NaF可能是以时间-浓度依赖性的方式导致Sf9细胞凋亡和基因损伤的。 3. NaF对Sf9细胞蛋白质表达的影响 采用二维电泳结合质谱技术，对半抑制浓度NaF处理72 h的Sf9细胞蛋白质组进行分离鉴定，成功得到了17个差异表达蛋白质的注释信息，其中7个蛋白表达上调，10个蛋白表达下调。GO分析结果显示，这些蛋白分别参与了催化，蛋白结合，绑定以及细胞学过程。RT-qPCR验证结果显示，大多数差异蛋白与基因水平表达一致。 4. NaF对Sf9细胞代谢水平的影响 Sf9细胞经不同浓度NaF (0, 1×10-5, 1×10-4, 1×10-3, 1×10-2 M)处理72 h或经半抑制浓度NaF处理0 h, 24 h, 48 h和72 h后，检测细胞线粒体膜电位和胞内ROS产生情况。结果显示，红/绿荧光比值随着NaF处理浓度的增加以及处理时间的增长而逐渐减小，ROS的生成呈时间-浓度依赖性的方式增加。以上结果表明， NaF处理可能导致细胞线粒体膜电位逐渐下降，细胞内ROS增多，进一步加重了对线粒体的损伤，引起Sf9细胞代谢异常。

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第一章 绪论

1.1 自然界中氟化物污染的基本概况

1.1.1 氟的基本性质和分布情况

1.1.2 氟化物的摄入和排泄

1.1.3 氟与其他离子结合的毒性

1.1.3.1 氟与碘

1.1.3.2 氟与铝

1.1.3.3 氟与铅

1.2 氟化物对生物体的危害概述

1.2.1 氟化物对植物的毒性

1.2.2 氟化物对昆虫的毒性

1.2.3 氟化物对人和驯养动物的毒性

1.2.3.1 对骨头和牙齿的毒性

1.2.3.2 神经系统毒性

1.2.3.3 生殖系统毒性

1.2.3.4 免疫系统毒性

1.2.3.5 肝脏和肾毒性

1.2.3.6 肺毒性

1.3 氟化物毒性机制的研究进展

1.3.1 线粒体毒性

1.3.1.1 线粒体膜电位和渗透性改变

1.3.1.2 氧化压力

1.3.2 细胞凋亡与坏死

1.3.3 内质网应激

1.4 课题相关实验技术介绍

1.4.1 细胞活性和增殖的检测

1.4.2 细胞凋亡检测

1.4.2.1 细胞凋亡形态学检测

1.4.2.2 DNA片段化检测

1.4.2.3 Annexin-V/PI法检测细胞凋亡和细胞坏死

1.4.3 细胞代谢水平检测

1.4.3.1 细胞线粒体膜电位检测

1.4.3.2 细胞内活性氧水平检测

1.4.4 蛋白质分离和质谱技术

1.4.4.1 二维电泳技术

1.4.4.2 质谱技术

1.4.5 实时荧光定量PCR技术

1.5 本课题的研究目的和主要内容

1.5.1 课题研究目的

1.5.2 主要研究内容

1.5.3 技术路线

氟化钠对Sf9细胞形态及细胞活性增殖的影响

2.1 实验材料

2.1.1 细胞系

2.1.2 主要试剂和来源

2.1.3 实验仪器

2.1.4 主要试剂配制

2.2 实验方法

2.2.1 Sf9细胞培养

2.2.2 Sf9细胞染氟处理

2.2.3 Sf9细胞活性检测

2.2.4 Sf9细胞增殖情况检测

2.3 实验结果与分析

2.3.1 氟化钠对细胞形态的影响

2.3.2 氟化钠对Sf9细胞活性的影响

2.3.3 氟化钠对Sf9细胞增殖的影响

2.4 小结与讨论

氟化钠对Sf9细胞凋亡和细胞坏死的影响

3.1 实验材料

3.1.1 细胞系

3.1.2 实验试剂和试剂盒

3.1.3 实验仪器

3.1.4 主要试剂的配制

3.2 实验方法

3.2.1 吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色检测Sf9细胞形态学凋亡

3.2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡情况

3.2.3 DNA ladder检测细胞凋亡

3.3 实验结果

3.3.1 Sf9细胞形态学凋亡

3.3.2 Sf9细胞凋亡检测

3.3.3 氟化钠对Sf9细胞DNA的影响

3.4 小结与讨论

第四章 氟化钠对Sf9细胞蛋白质组学的影响

4.1 实验材料

4.1.1 细胞系

4.1.2 主要试剂和试剂盒

4.1.3 实验仪器设备

4.1.4 二维电泳实验相关试剂配制

4.1.5 凝胶染色试剂及配制

4.1.6 质谱鉴定相关试剂及配制

4.1.7 RNA提取相关试剂配制

4.2 实验方法

4.2.1 细胞培养

4.2.2 细胞处理与收集

4.2.3 总蛋白质提取

4.2.4 蛋白浓度测定

4.2.5 二维电泳

4.2.5.1 第一向等电聚焦(IEF)

4.2.5.2 胶条平衡

4.2.5.3 第二向SDS-PAGE

4.2.6 凝胶染色与图像分析

4.2.6.1 考马斯亮蓝G-250染色

4.2.6.2 PDQuest软件图像分析

4.2.7 质谱鉴定

4.2.7.1 样品处理及检测

4.2.7.2 质谱分析及数据库比对

4.2.8 差异蛋白点GO分析

4.2.9 Sf9细胞总RNA提取及反转录

4.2.10 实时荧光定量PCR引物设计

4.2.11 实时荧光定量PCR

4.3 实验结果与分析

4.3.1 蛋白质提取

4.3.2 二维电泳结果

4.3.3 质谱鉴定结果

4.3.4 GO分析结果

4.3.5 Sf9细胞总RNA提取及内参基因的筛选

4.3.6 差异蛋白基因实时荧光定量PCR结果

4.3.7 差异蛋白基因实时荧光定量PCR产物胶图

4.4 小结与讨论

第五章 氟化钠对Sf9细胞代谢水平影响的初步研究

5.1 实验材料

5.1.1 细胞系

5.1.2 主要试剂和试剂盒

5.1.4 主要试剂配制

5.2 实验方法

5.2.1 细胞线粒体膜电位检测

5.2.2 细胞氧化水平检测

5.3 实验结果

5.3.1 氟化钠对Sf9细胞线粒体膜电位的影响

5.3.2 氟化钠对Sf9细胞ROS产生的影响

5.4 小结与讨论

第六章 总结与展望

6.1 总结

6.2 展望

参考文献

致 谢

在校期间发表的论文

参加课题情况